Штамм вниигенетика-225-5,продуцирующий 5" инозиновую кислоту Советский патент 1976 года по МПК C12K1/02 C12D13/06 

гладкая, блестящая, со слабой концентрической исчерченностью.

Посев штрихом на МПА. При инкубации в течение 24 ч при 28-30°С, рост умеренный, край гладкий, блеск влажный, жирный, поверхность гладкая, на свет не просвечивает, цвет бледно-желтый, консистенция маслянистая.

Посев уколом. Рост на поверхности, по длине укола рост отсутствует. В МПБ при инкубации в течение 24 ч при 28-30°С без встряхивания - слабое помутнение; на поверхности не образуется пленка, при встряхивании на качалке помутнение сильное. При стоянии образуется осадок бледно-желтого цвета.

Агаризованная среда Хоттингера. При пересеве на среду Хоттингера отдельных колоний, выросших на синтетической минимальной среде (состав приведен ниже), через 5-7 суток инкубации при 20-30°С образуется краснобурый пигмент.

Состав синтетической минимальной среды (на 1 л)

Глюкоза, г20

Мочевина, г2

(стерилизуется отдельно)

(NH4)2SO4, г3

КН2Р04, г1

К2НР04, г3

MgS04-7H20, г0,3

CaCl2-2H2O, мг10

Ре5О4-7П2О, мг10

MnCl2-4H2O, мг3,6

Аденин, млм0,2-0,5

Цистеин, мг20

Тиамин, мг5

Пантотенат Са, мг10

Биотин, мкг30

Вода, лдо 1

рН7,0-7,3

При приготовлении агаризованной среды добавляют агар - агар - 20 г.

Агаризованная синтетическая минимальная среда. Рост отсутствует, нуждается в добавке аденина, при добавлении аденина (0,2- 0,5 ) рост в течение двух суток при 30°С. Колонии сплошные, круглые, блестяш,ие, с ровным краем, цвет бледно-желтый, диаметром 0,5-0,8 мм. При добавлении аденин-5монофосфорной кислоты штамм образует мелкие колонии диаметром 0,2-0,3 на 4-5 сутки роста при 28-30°С.

Жидкая синтетическая минимальная среда с добавлением аденина. Рост в течение 24 ч при 28-30°С с интенсивной аэрацией. Помутнение сильное, запах отсутствует. В отличи от штамма АТСС 6872, штамм ВНИИгенетика-225-5 не образует осадка в течение 3-5 ч стояния и суспензия не просветляется.

Па ломтиках картофеля рост обильный, после инкубации в течение 24 ч при 28-30°С, цвет культуры зеленовато-желтый. Пигмент на картофеле не образуется.

Биохимические свойства.

Желатину разжижает слабо.

Па крахмальном агаре роста нет.

Па молоке рост отсутствует, свертывания и пептонизации нет.

Клетчатку не разрушает и не усваивает.

Крахмал не гидролизует и не усваивает.

Питраты не восстанавливает.

Отношение к углеводам.

Глюкозу, фруктозу усваивает.

Лактозу и галактозу не сбраживает.

Оптимальный рост при 28-30°С.

Выход 5инозиновой - 6-8 г/л.

Штамм ВНИИгенетика-225-5 является ауксотрофом по аденину.

Антагонистических свойств не обнаружено.

Хранят штамм в виде лиофильно высушенных культур в стеклянных ампулах, а также на агаре Хоттингера под вазелиновым маслом.

Пример. Использование штамма для получения инозиновой кислоты.

Для выраш;ивания посевного материала и процесса ферментации штамма ВПИИгенетика-225-5 применялись следуюш,ие питательные среды.

Среда для выраш,ивания посевного материала, г/л:

Дрожжевой экстракт

10,0

Пептон

10,0

Глюкоза

20,0

NaCl

2,0

Н2О

до 1 л

рН 7,2-7,3

реда для процесса ферментации, г/л

КП2Р04

10,0 К2ПРО4 10,0

MgSO4-7H2O 10,0

СаС12-2П2О

0,1

Ре5О4-7П2О 0,01

Мочевина

6,0

Цистеин 0,02

Тиамин 0,05

Никотиная кислота 0,05

Пантотенат кальция 0,01

0,001

nS04-7H2O 3-10-5

Биотин Аденин 0,001 nCl2-4H2O 0,04 100,0 люкоза

дистиллированная до 1 рН8,3

Для засева посевной среды используют суточную культуру штамма ВПИИгенетика-225-2,

выращенную на агаризованной среде Хоттингера. Посевной материал выращивают в колбах на качалке 200-220 об/мин в тачение суток при 28-30°С. Для засева ферментационной среды используют 2-4% посевного материала, и 30 мл среды помешают в колбу Зрленмейера емкостью 250 мл. Процесс ферментации проводят на качалке при 28-30°С. Через 6 суток ферментации уровень накопления инозиновой кислоты в культуральной жидкости составляет 6-8 г/л.

Инозиносую кислоту определяют методом хроматографии на бумаге в системе растворителей Н-пропанол-аммиак-БОда (6:3:1) используя стандартные растворы чистого препарата динатриевой соли инозиновой кислоты ХТНоО. Для анализа используют пластипки «Silufo с тонким слоем силикагеля и люминофора на алюминиевой фольге.

Выделение инозиновой кислоты из культуральной жидкости.

В нагретую до 70°С культуральную жидкость добавляют окись кальция в количестве 2%. Затем рН раствора доводят до 6,0 концентрированной ортофосфорной кислотой и биомассу отфильтровывают. Фильтрат пропускают через колонку с макропористым ионосорбентом ИА-1. Десорбцию нуклеотида проводят 0,3 н. НС1. С целью нейтрализации солянокислый элюат, содержащий инозиновую кислоту, пропускают через колонку с анионитом ЭДЭ-10 (в ОН-форме). Фракции, содержащие кислоту, объединяют и концентрируют в вакууме при 50°С. К концентрату при рН 8-9 добавляют четырехкратное количество этилового спирта, осадок перекристаллизовывают из раствора С2Н5ОН : 0,1 н. NaOH : НзО-2 : 1 : : 1. Полученные кристаллы идентифицируют с помощью УФ-спектров поглощения, а также путем разложения выделенного кристаллического вещества.

Выделенное вещество (инозин) гидролизуют в 1 н. НС1 в течение 1 ч. Полученные соединения идентифицируют как гипоксантил (основание, входящее в состав инозина и кислоты) с помощью хроматографии на бумаге в трех указанных выще системах растворителей.

Формула изобретения

Штамм Brevibacterium ammoniagenes ВНИИ генетика-225-5, продуцирующий 5-инозиновую кислоту. Хранится в музее культур института «ВНИИгенетика, регистрационный номер В-1073.

Л1орфо. ОГ1ч ч-к :с i:pii3i aKii. Палочка грамполо ;п1тсл::1Г1;. нспод; ижьл:, раямером 0.6- 1,OXU5-2i.i. Спор не образует.

Культуральные и ф 1зио:1эгическ11е признаки. Мясо-пептокиь) агас (МПЛ). Колоппи мелкие, круглой формы, сплогпиыс, с ровным крае:, бледно-желтого цг.ста. Днал-етр колоний дзухс}точ11ой культуры -- 1 -- 1.5 мм. ПоFsepxHocTb гладкая, б.лестящая, со слабой концентрической исчерчениостью.

Посев штрихом на МП.-. У односуточной культуры рост умеренный, край гладкий, блеск влажный, жирный, поверхность гладкая, не просвечивающаяся на свет.

Агаризованная среда Хоттипгера. Пяти-семисуточная культура пигментирует среду при 20--30 С.

Синтетическая минимальная среда. Рост отсутствует.

Синтетическая минимальная среда с добавлением аденина. Двухсуточная культура при добавлении 0,2-0.5 аденпна образует колонии диаметром 0,5-0,8 мм. Колонии сплошные, круглые, блестящие, с розным краем, бледно-желтого цвета.

Четырех-пятпсуточпая культура пр добавлении 0.2-0,5мли аденозин-5-монофосфорной кислоты образует отдельные колонии 0,2- 0,3 мм.

При росте на мясо-пептонном бульоне в жидкой синтетической минимальной среде через 24 ч. инкубации слабое помутнение, при аэрации помутнение сильное.

Картофель. Культура зеленовато-желтого цвета, пигмента не образует.

Биохимические свойства. Адениннедостаточный ауксотроф. Желатину слабо разжижае. Крахмал и клетчатку не усваивает. Молоко не пептонизирует. Ни граты не восстанаБливает.

Отношение к углеводам. Глюкозу, фруктозу усваивает. Лактозу, галактоз не сб)иукпваст. Оптимальный рост при 28-30°С. Выход 5 инозиновой кислоты - 6-8 г/л.