Способ получения уридин-5 @ -монофосфата и урацила Советский патент 1987 года по МПК C12P1/04 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности, к получению пиримидиновых производных, а именно, уридин-З -монофосфата и урацила путем культивирования продуцирующих их микроорганизмов в аэробных условиях на питательной среде способом прямой ферментации.

Уридин-5 -монофосфат (уридиновая кислота, З-УМФ, уридин-5-монофосфорная кислота УМФ) и урацил являются структурными компонентами рибонуклеиновых кислот, УМФ и урацил находя применение в пищевой промышленности, фармакологии и служат исходными соединениями для синтеза антиканцерогенных и антибактериальных препаратов, 5 -УМФ и урацил используются также в качестве .реактивов в различных областях экспериментальной биологии.

Известен способ, основанный на микробиологическом синтезе 5-УМФ методом прямой ферментации с помощью актиномецентов определенньпс видов.

Известен также способ получения урацила путем микробиологического синтеза с помощью салмонелл.

Известные способы получения 5 -УМ методом прямой ферментации с помощью актиномицетов имеют следующие недостатки: максимальньй выход5-УМФ по патенту Японии низкий и составляет менее 1 г/л при продолжительности ферментации 168 ч на среде, содержащей в качестве источников углерода глюкозу, декстран, мальтозу; в качестве источников азота пептон, мочевину, нитраты.

Получение урацила методом прямой ферментации с помощью культуры салмонелл также имеет недостатки: максимальный выход урацила низкий и составляет около 0,1 г/л при культивировании культуры на питательной ереде, содержащей глюкозу, ми«еральные соли, казаминовые кислоты.

Целью изобретения является разработка простого и эффективного микробиологического способа получения ури дин-5 -монофосфата и урацила методом прямой ферментации на основе использования отечественного бактериального штамма. В предлагаемом способе в качестве продуцента уридин-З-монофосфата и урацила используют мутантный штамм культуры Brevibacterium ammonigenis ВНИИгенетика-63, вьщеленный из штамма АТСС 6872 путем введения в геном исходного штамма ряда последовательнь х мутаций, в том числе устойчивость к высоким концентрациям 3-фторурацила. Штамм ВНИИгенетика-63 хранится в Центральном музее промьш1ленных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промьш - ленных микпроорганизмов и имеет регистрационный номер ЦМПМ В-2198.

Характеристика штамма Вг. ammonigenis ВНИИгенетика-63.

Штамм ВНИИгенетика-63 - грамположительная палочка, не образующая спор. На мясо-пептонном агаре и полт ноценной агаризованной среде Хоттингера образует колонии круглой формы, сплошные, с ровным краем, бледножелтого цвета, диаметром 1-1,3 мм. Штрих на агаризованной среде Хоттингера: после инкубации в течение 24 часов при 30 С наблюдается значительный рост. Штамм ВНИИгенетика-63 ауксотроф ный мутант, нуждающийся для роста в аденине. Максимальный выход 3 -ЖФ при культивировании данного штамма составляет 3-4 г/л и урацила 2-4 г/л после 144 ч ферментации на синтетической среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу, источника азота - мочевину, источника ростйвых факторов - аденин тиамин, пантотенат кальция, никатиновую кислоту. Юроме уридин-З -монофасфата и урацила, штамм ВНИИгенетика-63 накапливает до 2 г/л инозин3 -монофосфата и до 0,7 г/л гипо- ксантина.

Отличительной особенностью штамма ВНИИгенетика-63 является способность к интенсивному образованию краснобуро гр пигмента после инкубации на полноценной питательной агаризован- ной среде в течение 48 ч. Данный признак удобен для тестирования, отбора, идентификации и хранения про- дуцента З-УМФ и урацила, что облегчает контроль за чистотой культуры при использовании предлагаемого способа.

Способ осуществляется-следующим образом.

В качестве продуцента уридин-З монофосфата и урацила используют мутантный штамм Вг. ammonigenis ВНИИгенетика-63 Культуру, выращенную на агаризованной среде Хоттингера в течение 24 ч при 28 - 30 С, переносят в колбы с посевной средой и выращивают при постоянном перемешивании и аэрации в течение 20 - 24 ч при температуре 28 - 30 С. Затем посевной материал переносят в ферментационную среду. Процесс биосинтеза осуществляют в колбах на качалке (240-270 об/мин) при аэрации и перемешивании, соответствующих скорости растворения кис лорода 2-3 г при температуре 28 - . Посевная и ферментационная среды содержат в качестве источника углерода - глюкозу, источника азота - мочевину, источника ростовых факторов - пептон, дрожжевой Экстрак аденин, тиамин, никатиновую кислоту, пантотенат кальЦия, а также минераль ,Hbie соли (, , MgSO, , FeSO, ZnSO, MnCl, NaOH). Способ, основанный на использовании предлагаемого штамма, обеспечивает выход уридин-5 -монофосфата 3 4 г/л и урацила 2-4 г/л без добавления в среду предшественников данных соединений. Помимо этого, в среде накапливается инозиновой кислоты 1,5-2 г/л и гипоксантина 0,5-0,7 г/л Предлагаемый способ получения уридинт5 -монофосфата и урацила методс м прямой ферментации создает воз можность организации промьшшенного производства этих соединений на пред приятиях микробиологической и медицинской промьшшенности. , Пример использования предполагаемого изобретения. Культуру штамма Вг. aimnonigenis ВНИИгенетика-63, выращенную в течени 24-48 ч при 28 - на агаризованной среде Хоттингера с добавлением аденина (5-10 мкг/мл), переносят на жидкую посевную среду следующего состава, %: глюкоза - 2,0; пептон - 1,0; дрожжевой экстракт - 1,0; NaCl-0,25. Посевной материал выращивают в колбах емкостью 750 мл, содержащих 100 мл среды, на качалке, делающей 220 - 240 об/мин., в течение 20 24 ч при 28 - 30°С. Инокулят передают в ферментационную среду в количестве 4-6%. Состав ферментационной среды, %: Раствор В Раствор 1,0 10 1,0 К,НР04 Глюкоза 0,25 100 мм 1,0 MgSO 0,01 CaCl 0,001 FeSO 7HjO 0,0001 ZnSO 0,001 MnClj 100 мл стерилизации растворы А и Б сливают и добавляют стерильно растворы до конечной концентрации, %: мочевины - 0,6, тиамина - 0,0005, никатинрвой кислоты - 0,0005, панотената кальция - 0,001, аденина - 0,001; 0,0015, рН среды 7,8-8,2. Процесс ферментации проводят в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, содержащих 30 мл среды, соответствующей скорости растворения кислорода 2 - 3 г Oj/л ч при температуре 28 30 С на качалке, делающей 220 240 об/мин. После 144 ч ферментации в культурапьной жидкости накапливается уридинмонофосфата 3-4 г/л, урацила 2-4 г/л, а также инозиновой кислотый 1,5 - 2,0 г/л и гипоксантина 0,5 - 0,7 г/л. Выделение уридин-5 -монофосфата и урацила осуществляют известными способами.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УРИДИН-5 МОНОФОСФАТА И УРАЦИЛА, включающий культивирование продуцирующих их микроорганизмов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, ростовые факторы, минеральные соли, и последующее вьщеление из культуральной жидкости целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности и упрощения способа, в качестве продуцента используют Штамм Brevibacterium ammonigenes ВНИИгенетика-63..