Способ получения интерферона Советский патент 1977 года по МПК A61K38/21 

Изобретение относится t области медицины, точнее к способам получения медицинских препаратов, а именно интерферона. Известен способ получения интерферона путем воэде1Й:твия на лейкоциты, выделенные из донорской крови и взвешенные в пи тательной среде, вирусом - ингерфероногеном с последующим удалением лейкоцитов, нейтрализацией вируса-интерфероногена, очисткой и лиофильным высушиванием. Однако известный способ не обеспечивает получения шрепарата с достаточно концентрированной активностью. Цель предлагаемого изобретения - повышение качества препарата и концентриро вание его активности. Для этого интерферонсодержащую культуральную жидкость пропускают через молекулярные разделители,например, Сефаде Г-25 грубый, Для получения интерферона по предлага емому способу выделенные из донорской крови лейкоциты взвешивают всреде № 1 (л.О лейкоцитов на 1 мл преды), содержащей 10О ед/мл пеницилина,, 50 ед/мл стрептомицина н 10 ед/мл гепарина, перено. сят в стерильные матрицы из нейтрального стекла и добавляют 5 % плазмы или сыворотки крови человека. В качестве вируса-и1« терфероногена используют вакцинный штамм И вируса болезни Ньюкасла в количестве 1О-100 на ле йкоцит или 10-20 гемагглютинирующих единиц на 10 лейко-. цитов. Вирус вводят в среду с лейкоцитами и инкубируют взвесь 3 ч при 37 С в стационарном горизонтальном положении. лейкоциты отделяют центрифугированием при 125Og в течение 15 мин. Осадок лейкоцитов pecycпe диpyют в свежей порцищ среды № 199 (1О лейкоцитов на 1 мл среды), содержащей указанное выше количество антибиотиков и гепарина, добавляю 5-10% плазмы или сыворотки крови, переносят в матрацы и инкубируют в тех же условиях 18-20 ч. По окончании инкубаци« клетки отделяют центрифугированием при 15OO-2OOOd в течение 15 мин, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость повторно центрифугируют. К очищенной кя кости добавляют 1О-20%-ный раствор соляной кислоты до рИ 2,2-2,4 и выдерживают не менее 4-5 суток при 4 С, посл neio отбирают образцы для контроля стерильности, токсичности и активности.

Стерильность контролируют высевом 1

мл раствора на бульон с тиогликоллатом и бульон Сабуро, После Ю суток инкубации бульона -с тиогликоллатом при 37 С и бульона Сабуро при 20 С посевы до,.жны оставаться стерильными. Вирусологическую стерильность определяют введением по 0,2 м жидкости в пробирки с 3-суточной культурой куриных фибробластов. Через 3-4 суток при наблюдении под микроскопом в MOiiOcnoe клеток не должно быть признаков цитоплати- ческого действия. Дополнительный контроль проводят путем введения 0,2 мл жидкости в аллантоисную полость 9-10-дневных куриных эмбрионов; через 3 суток инкубации при 37 С не должно быть гибели эмбрионов и отобранная из них аплантоиспая жидкость не должна содержать гемагглютининов петушиных эритроцитов. Противовирусную активность раствора определяют по задержке ш топатического действия вируса возикулярного стоматита (вакцинный штамм Индиана, взятого в дозе 1ОО ТЦДдд в культуре клеток первично-трипсинизированной кожно-мышечной ткани Ю-12 недельн-ых эмбрионов человека или в перевиваемой

культуре диплоидных клеток кожно-мышечной ткани эмбрионов человека. Титр противови- русной активности должен составлять не менее 32 ед/мл в культуре фибропластов и не менее 25О ад/мл в культуре диплоидных клеток. Определение токсичности проводят в монослойной культуре клеток кожно-мы-; шечной ткани эмбрионов человека. В культуру со сформированным монослоем вводят 1 мл разведения 1:16 (первично-трипсиниэированная культура) или 1:1ОО (диплоидная культура) в среде с гидролизатрм пакта льбумина, № 199 или Игла. Через 2-3 суток инкубации при 37 С не должно быть никаких признаков дегенерации монослоя и морфология клеток должна оставатьс неизменной..

для концейтрирования активности проверенную интерферонсодержашую культуральную жидкость через систему сифонов под давлением в условиях стерильности и герметичносги подают в колонку, заполненную заранее подготовленным молекулярным раэделителем -Сефадекс Г-25 грубый. При диаметре колонки 6О JMM и высоте

тонат(-ко|:)нчнеЕип1 онапесиеииии растн(фа или -с помощью прогочного денсиметра. После прекрпшония апалесоемпии отбор белковой фракции превращают. Элюат контролируют на бакгериологическуи) стерильность и на полноту очистки ог низкомолекулярных веществ. Последнюю проверяют пробой на феноловый красный, когорьи присутствует в исходной жидкости и должен целиком оставаться во фракции иизкомолекупярных веществ (при подщелачивании пробы белково фракции не должно отмечаться покраснения, раствора). Проверенный э/(юат разливают в стерильные ампулы и замораживакэт jnpu гемператур° -40 С. Затем из ампул откачивают воздух и подогревают до температуры не выше 30-35 С в течение 48-72 ч. После высушивания ампулы запаивают под вакуумом. Остаточная влажность не должна превышать 4%. Готовую продукцию вновь контролируют на бактериологическую и вирусологическуюг стерильность, токсичность, а также безвредность путем внутрибрюшин- ного введениям «белым : мышам весом 10-12 г по 0,5 мл раствора препарата. При наблюдении в течение 5 суток мыши должны оставаться здоровыми. Кроме тогэ контролируют физические свойства, растворимость и остаточную влажность препарата.

Для подготовки геля Сефадекс Г-25 грубый необходимое количество смолы заливают О,05-О.1% раствором поваренной соли в дистиллированной воде и выдерживают 2-3 суток при 4 С. Затем многократной декантацией отделяют мелкую фракцию смлы, а остаток загружают в герметично закрьшм ю колонку. Через слой геля пропускают 5 объемов дистиллировайной воды, после чего в колонку вводят 5% раствор. . формальдегида и оставляют на 1 сутки. Для удаления формальдегида через гель пропускают 10 объемов стерильной дистиллирсхванной воды, последние порции которой на выходе из колонки проверяют на стерильность. После осуществления цикла очистки культурной жидкости и элюции белковой ({ракции элюируют низкомолекулярные веш.ества пропусканием 10 объемов стерильной дистиллированной воды. В случае уплотнения слоя геля и гнижеиия скорости фильтрования гель извлекают из колонки, отделяют мелкую фракцию и вновь подвергают вышеуказанной обработке.

s6

среде вирусом-интррферогеном с пос епуюншм качеггпа препарата и коршенгрироняннл его

удалением лейкони rf.«, нмйгрализааией виру-активности, интв114«ронсоп8ржашую культуса-нигерферогенв, очисткой и лио4|илы1ым{«льную жидкость пропускают через MojfOKyвысушиванием проиукга, отличаю-лярнне разделители, например, Сефапвкс

щ и и с я тем, что. с целью повышения ,Т-25 грубый.

2972Пв