СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУБЪЕДИНИЧНОЙ ГЕННОИНЖЕНЕРНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕПАТИТА В Российский патент 1996 года по МПК G01N33/576 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к вакцинному производству, и может быть использовано для создания высокочувствительных диагностикумов для выявления вируса гепатита В и для специфической профилактики гепатита В.

Известны способы приготовления вакцины против гепатита В на основе препарата инактивированного НВs Ag, полученного из плазмы или сыворотки крови хронических носителей НВs Ag (4). Эти способы имеют ряд существенных недостатков, основными среди которых являются многочисленные трудоемкие приемы выделения, очистки, в особенности от белков сыворотки человека, и инактивации НВs Ag, а также возможность контаминации исходного обрабатываемого сырья (плазмы крови) сопутствующими вирусами (вирусами гепатита на А-ни В, вирусом иммунодефицита человека и др.). Существует риск заражения вирусным гепатитом В среди лиц, осуществляющих технологический процесс выделения и очистки НВs Ag из плазменного сырья. Кроме этого имеет место достаточно низкий выход целевого продукта 10%
Известен способ получения живой оспенно-гепатитной В вакцины для профилактики гепатита В и натуральной оспы с использованием рекомбинантов вируса оспо-вакцины (РВОВ), которые последовательно дважды пассируют в различных биологических системах и полученный на завершающей стадии из соскоба кожи теленка вируссодержащий материал гомогенизируют, очищают, концентрируют и лиофилизуют (2). Целевой продукт живая оспенно-гепатитная В вакцина - индуцирует НВs Ag в культуре клеток и антитела к НВs Ag у кроликов, однако не может быть использована для специфической профилактики гепатита В у людей, в особенности в группах риска, в силу своей нейровирулентности, вызванной присутствием живого РВОВ. Кроме того для получения защитных титров анти-НВs антител необходимо многократное введение препарата, а как известно, вирус оспо-вакцины плохо репродуцируется в иммунном организме, что исключает возможность эффективного использования живой оспенно-гепатитной В вакцины для профилактики гепатита В у людей (5).

Наиболее близким по сущности к заявляемому решению является способ получения вакцины к гепатиту B описанный в работе в Wampler D.E. et al. PNA 9, 1985, v. 82 6830-6834.

Предлагаемое изобретение заключается в том, что в способе получения субъединичной генно-инженерной вакцины против гепатита В, включающем накопление генно-инженерного НВs Ag, выделение и его очистку, для накопления НВs Ag используют развивающиеся куриные эмбрионы при непосредственном их заражении РВОВ в аллантоисную полость или культуру клеток, а выделение и очистку НВs Ag осуществляют последовательно методом каскадной мембранной фильтрации, причем размер пор одной из мембран не превышает 0,15 0,22 мкм, и аффинной хроматографией на иммуносорбенте, в качестве которого используют иммобилизованные на СNBr активированной агарозе 4В поликлональные специфические антитела к НВs Ag, а элюцию проводят цитратно-фосфатным буфером pН 2,0-2,4 и 8М мочевиной pН 2,0-4,2.

Использование каскада мембран на этапе предварительной очистки вируссодержащего материала позволяет удалить инфекционный РВОВ, растворимые поксвирусные антигены и примесные белки хозяина с выделением в фильтрат НВs Ag с полным сохранением биологической и антигенной активности целевого продукта НВs Ag, а использование специфического иммуносорбента на основе поликлональных антител анти-НВs в оптимальных условиях элюции цитратно-фосфатным буфером pН 2,2 и 8М мочевиной pН 2,2 обеспечивает высокую степень очистки НВs Ag от контаминирующих примесных белков (в 3000 раз), содержание примесей по данным электрофореза в полиакриламидном геле не превышает 5-7% и в частности специфического белка системы-хозяина овальбумина в дозе вакцины не более 60 нг и позволяет получать на этом этапе до 80-90% НВs Ag.

Отличительные от прототипа признаки и их свойства порознь являются известными. Каждый из них вносит определенный результат в получаемый эффект.

Так известно использование системы развивающихся 9-11 дневных куриных эмбрионов, при котором заражение РВОВ производится непосредственно в аллантоисную полость эмбриона, или культуры клеток для накопления генно-инженерного НВs Ag (1, 3).

Также известным является применение методов мембранной микрофильтрации и аффинной хроматографии в вирусологической практике на различных этапах очистки биологических суспензий (7, 9). Однако не было обнаружено информации об использовании всех этих признаков вместе. Поэтому совместное использование системы куриных эмбрионов или культуры клеток и методом мембранной каскадной фильтрации и специфической иммунноаффинной хроматографии в выбранных режимах является новым признаком и дает новый сверхсуммарный результат: позволяет получить высокоочищенный генно-инженерный НВs Ag с более высоким выходом целевого продукта (до 90% ) и содержанием не более 5-7% примесных белков; Морфологическая однородность НВs Ag (размер частиц 25-27 нм) и чистота подтверждены методом электронной микроскопии на JAM при 100 кВ и увеличении 50000 и 100000 и данными электрофореза в полиакриламидном геле (менее 7% примесных белков).

Пример 1. Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости, содержащей НВs Ag. Заражают 400 развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) в возрасте 9-10 дней непосредственно в аллантоисную полость дозой 0,1 мл, содержащей 10^7,0 ООЕ в 1 мл рекомбинантного ВОВ, экспрессирующего НВs Ag. После заражения РКЭ инкубируют при температуре 37^o в течение 72 часов, охлаждают при температуре +4^o в течение 18 часов и вскрывают. Аллантоисную жидкость собирают в специальные флаконы и тестируют на НВs Ag. Объем собранной аллантоисной жидкости составляет 2000 мл. Определение концентрации НВs Ag проводится методом иммунно-ферментного анализа (коммерческая тест-система Горьковского НИИ эпидемиологии и микробиологии) с использованием стандартного раствора НВs Ag производства фирмы Abbott (США). Концентрация НВs Ag составляет 300 нг/мл. Собранную аллантоисную жидкость замораживают до -18^oC.

Получение полуфабриката вакцины.

Аллантоисную жидкость в объеме 2000 мл, содержащую 300 нг/мл НВs Ag, размораживают, фильтруют через стеклянные воронки с восьмислойными марлевыми фильтрами и пропускают последовательно через каскад мембран из картонного фильтра типа КФБЖ и синтетической мембраны "Владипор" с диаметром пор 0,22 мкм. Производительность процесса микрофильтрации 1,5-2 л/час на ячейке типа ФМО 2-1000 и 5-6 л/час на фильтрующих модулях БФД размером 293 мм при давлении эффективном до 4 кГС/см². Получают 2000 мл осветленной аллантоисной жидкости с концентрацией НВs Ag 295 нг/мл. Далее полученный фильтрат аллантоисной жидкости концентрируют по объему в 4 раза до 500 мл на мембране типа УПМ-П с диаметром пор 0,05 мкм в ячейке ФМО 2-1000 или на полых волокнах с пределом задержания до 15 тыс.дальтон на АР-0,2 в установке УПЛ-06 (производство Кириши, Ленинград). К полученным 500 мл концентрата аллантоисной жидкости добавляют 0,01 М фосфатный буферный раствор, pН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl до общего объема исходного 2000 мл и проводят диаконцентрирование НВs Ag до конечного объема 500 мл. Полученный полуфабрикат вакцины содержит 1000 нг/мл НВs Ag и не содержит РВОВ (по данным РНГА с антительным диагностикумом на антиген ортопоксвирусов и определения инфекционной активности РВОВ на хорионаллантоисной оболочке куриных эмбрионов). Выход НВs Ag составляет 83%
Иммуноаффинная хроматография.

Для приготовления иммуносорбента используют специфические поликлональные анти-НВs антитела, выделенные из гипериммунной козьей или ослиной сыворотки. Для выделения иммуноглобулинов к 10 мл гипериммунной сыворотки прибавляют равный объем дистиллированной воды и по каплям, при постоянном помешивании, 13,3 мл насыщенного раствора сульфата аммония (до 40% насыщения). Смесь перемешивают 15 минут на магнитной мешалке и оставляют при комнатной температуре на ночь. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 минут и растворяют в 10 мл 0,15 М раствора хлорида натрия. Объем полученного раствора доводят до 20 мл дистиллированной водой и при перемешивании добавляют 13,3 мл насыщенного раствора сульфата аммония. Смесь перемешивают 15 минут при комнатной температуре, центрифугируют 15 минут со скоростью 4000 об/мин. Осадок растворяют в минимальном количестве 0,01 М фосфатного буфера, pН 7,2, содержащем 0,15 М NaCl. Получают 4,5 мл раствора иммуноглобулинов с концентрацией 50 мг/мл. Далее раствор иммуноглобулинов подвергают обессоливанию, пропуская через колонку, заполненную 15 см³ геля сефадекса G-75 и уравновешивают 0,01 М фосфатным буфером, pН 7,2, содержащим 0,15 ММ NaCl. После полного вхождения раствора глобулинов в гель сефадекса на колонку наносят 0,01 М фосфатный буферный раствор, pН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl. Эффлюент контролируют на наличие белка с помощью 10% раствора трихлоруксусной кислоты, на наличие сернокислого аммония с помощью 10% раствора хлористого бария, визуально по помутнению капли на предметном стекле. Собранную белоксодержащую фракцию гель-фильтрата объемом 4,4 мл диализуют сутки против 0,02 М фосфатного буферного раствора, pН 6,6 и подвергают дальнейшей очистке на сефадексе ДЕАЕ-А-50. Для этого диализованный раствор белка центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 минут. Осадок удаляют, а центрифугат объемом 3,0 мл наносят на колонку с ДЕАЕ-А-50 (диаметр колонки 3,5 см, высота 14 см), предварительно уравновешенную 0,02 М фосфатным буферным раствором, pН 6,6. После полного вхождения раствора белка в гель его вытесняют 0,02 М фосфатным буферным раствором, pН 6,6, содержащим 0,17 М NaCl. Отбирают пиковую фракцию белка объемом 3 мл, в которой содержится 17 мг иммуноглобулинов.

Иммуносорбент готовят на основе СN-Br-активированной агарозы 4 В. Для этого 2 мл набухшей агарозы трижды промывают на фильтре Шотта 100 мл 0,001 НСl, суспендируют в 2 мл пришивочного буфера (0,15 М фосфатный буферный раствор, pН 8,2, содержащий 0,5 М NaCl). Буфер декантируют и добавляют к агарозе 2 мл предварительно забуференного 0,15 М Na₂HPO₄ раствора иммуноглобулинов. После двухчасовой инкубации на роторной мешалке при комнатной температуре и в течение ночи при 4^oС агарозу переносят на фильтр Шотта и отмывают несвязавшийся белок пришивочным буфером (0,15 М фосфатный буферный раствор, pН 8,2, содержащий 0,5 М MaCl). Иммуносорбент суспендируют в 2 мл 0,5 М глицина на пришивочном буфере. После инкубации в течение 2 часов при комнатной температуре агарозу переносят на фильтр Шотта и отмывают от нековалентно связанного белка пятикратно последовательным добавлением по 20 мл пришивочного буфера (0,15 М фосфатный буфер, pН 8,2, содержащий 0,5 М NaCl), глицинового буфера (глицин HCl, pН 3,0). Последнюю промывку осуществляют 0,15 М фосфатным буферным раствором, pН 7,2. Полученный иммуносорбент содержит 4,1 мг иммуноглобулинов.

Приготовленный иммуносорбент помещают в колонку с диаметром 0,55 см и высотой 6,3 см и наносят со скоростью 10 мл/час 500 мл полуфабриката вакцины с концентрацией НВs Ag 1000 нг/мл. Колонку промывают со скоростью 10 мл/час 0,15 М фосфатным буферным раствором, pН 7,2, содержащим 0,15 М NaCl, в объеме, равном 10-ти объемам колонки, т.е. 15 мл буфера, затем промываем последовательно с той же скоростью 15 мл 0,15 М Na₂HPO₄, pН 9,5 и 15 мл 0,15 М KH₂PO₄ pН 5,0. После этого сорбированный НВs Ag элюируют с иммуносорбента цитратно-фосфатным буфером pН 2,2 со скоростью 4 мл/час. Собранные фракции (по 3 мл) нейтрализуют добавлением 0,5 М NaOH до нейтральной реакции (pН 7,0), анализируют на содержание НВs Ag (РНГА, ИФА), овальбуминовых и неовальбуминовых примесей (РНГА и РИЭФ). Завершающую стадию десорбции НВs Ag с иммуносорбента проводят 8 М мочевиной, pН 2,2. Собранные на этом этапе фракции (по 3 мл) нейтрализуют добавлением 0,5 М NaOH до pН 7,0, объединяют и диализуют двое суток против физиологического раствора при 4^oC, анализируют на содержание НВs Ag (РНГА, ИФА), овальбуминовых и неовальбуминовых примесей (РНГА, РИЭФ). Полученные фракции очищенного НВs Ag объединяют и получают препарат объемом 30 мл с активностью НВs Ag 22,5 мкг/мл. Выход НВs Ag 90% от исходного полуфабриката. В препарат добавляют стерильно гидроокись алюминия до конечной концентрации 10 мкг/мл и суспензию разводят стерильно физраствором до 67 мл. Из полученного раствора отбирают аликвоты (объемом 3 мл) на анализ, остальное разливают в ампулы.

Вакцинная партия содержит 10 мкг/мл НВs Ag. Количество белковых примесей по данным электрофореза в полиакриламидном геле составляет не более 5% Выход НВs Ag 73% от исходного материала.

Пример 2. Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости и полуфабриката вакцины проводят по примеру 1, но фильтрацию исходного материала осуществляют через мембрану со средним диаметром пор 0,05-0,15 мкм. Получают полуфабрикат вакцины объемом 450 мл с концентрацией НВs Ag 800 нг/мл. Выход НВs Ag составляет 76% Производительность процесса 0,5-1 л/час на ячейке типа ФМО 2-1000 и 2-3 л/час на фильтрующих модулях БФД размером 293 мм при эффективном давлении до 4 кГС/см². Иммуноаффинную хроматографию полученного полуфабриката и приготовление вакцинного препарата осуществляют по примеру 1. Получают вакцинную партию препарата объемом 40 мл, которая содержит 10 мкг/мл НВs Ag. Количество белковых примесей не более 5% по данным электрофореза в полиакриламидном геле.

Выход НВs Ag 70% от исходного материала (или 85% от исходного полуфабриката).

Пример 3. Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости и полуфабриката вакцины проводят по примеру 1, но фильтрацию исходного материала осуществляют через мембрану МФА-МА N 3 со средним диаметром пор 0,25-0,35 мкм. Получают полуфабрикат вакцины объемом 470 мл с содержанием НВs Ag 745 нг/мл. Производительность процесса фильтрации 1,5-1,8 л/час на ячейке типа ФМО 2-1000 и 4,5-5,5 л/час на фильтрующих модулях БФД (диаметр мембраны 293 мм) при эффективном давлении до 4 кГС/см². Иммуноаффинную хроматографию полученного полуфабриката и приготовление вакцинного препарата осуществляют аналогично примеру 1. Получают вакцинную партию препарата объемом 29,9 мл, которая содержит 10 мкг/мл НВs Ag. Выход НВs Ag 60% Количество белковых примесей по данным электрофореза в полиакриламидном геле составляет 7%
Пример 4. Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости и полуфабриката вакцины проводят аналогично примеру 1, но фильтрацию исходного материала осуществляют через мембрану МФА-МА N6 со средним диаметром пор 0,55-0,65 мкм. Получают полуфабрикат вакцины объемом 490 мл с содержанием НВs Ag 900 нг/мл. Выход НВs Ag составляет 72% Производительность процесса 1,8-2 л/час на ячейке типа ФМО 2-1000 и 5-6 л на фильтрующих модулях (диаметр мембраны 293 мм) при эффективном давлении 4 кГС/см². Иммунноаффинную хроматографию полученного полуфабриката и приготовление вакцинного препарата осуществляют по примеру 1. Получают вакцинную партию препарата объемом 33 мл, которая содержит 10 мкг/мл НВs Ag. Выход НВs Ag 47% от исходного материала (75% от исходного полуфабриката). Количество примесных белков до 10%
Пример 5. Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости, полуфабриката вакцины и иммунноаффинную хроматографию проводят по примеру 1. В качестве буферов для элюирования НВs Ag используют цитратно-фосфатный буфер pН 2,0 и 8М мочевину pН 2,2 последовательно. Получают продукт объемом 42,5 мл, содержание НВs Ag в котором 10 мгк/мл. Количество белковых примесей по данным электрофореза в полиакриламидном геле не более 5% Выход НВs Ag составляет 85% от исходного полученного полуфабриката.

Пример 6. Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости, полуфабриката вакцины и иммунно-аффинную хроматографию проводят аналогично примеру 1. В качестве элюирующего буфера используют цитратно-фосфатный буфер pН 2,4 и 8М мочевину, pН 2,2 последовательно. Получают продукт объемом 43,7 мл с концентрацией НВs Ag 10 мгк/мл. и содержанием белковых примесей не более 6% Выход НВs Ag составляет 87% от исходного полуфабриката.

Пример 7. Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости, полуфабриката вакцины, иммуноаффинную хроматографию проводят по примеру 1. В качестве элюирующего буфера используют цитратно-фосфатный буфер pH 1,5 и 8М мочевину, pН 2,2. Получают продукт НВs Ag в объеме 39 мл с концентрацией 10 мгк/мл. Количество белковых примесей составляет не более 7% выход НВs Ag 78% от исходного полуфабриката.

Пример 8. Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости, полуфабриката вакцины и иммунноаффинную хроматографию проводят аналогично примеру 1. В качестве элюирующих буферов используют цитратно-фосфатный буфер pН 2,2 и 8М мочевину pН 2,0 последовательно. В полученном вакцинном препарате объемом 44,7 мл содержание НВs Ag составляет 10 мкг/мл, концентрация белковых примесей не более 5% Выход НВs Ag от исходного полуфабриката вакцины.

Пример 9. Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости, полуфабриката вакцины и иммунно-аффинную хроматографию проводят аналогично примеру 1. Элюцию НВs Ag с иммунносорбента осуществляют цитратно-фосфатным буфером, pН 2,2 и 8М мочевиной, pН 4,2. Объем полученного вакцинного препарата 35 мл, концентрация НВs Ag 10 мкг/мл, содержание белковых примесей по данным электрофореза в полиакриламидном геле не выше 7% Выход НВs Ag 70% от исходного полуфабриката.

Пример 10. Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости, полуфабриката вакцины и иммунноаффинную хроматографию проводят аналогично примеру 1. Элюцию НВs Ag с иммуносорбента осуществляют последовательно цитратно-фосфатным буфером, pН 2,2 и 8М мочевиной, pН 6,2. Полученный вакцинный препарат в объеме 28 мл содержит 10 мкг/мл НВs Ag. Количество белковых примесей около 10% выход НВs Ag составляет 57% по отношению к исходному полуфабрикату.

Пример 11. Получение вируссодержащей культуральной жидкости.

Приготовление маточного вируса в культуре клеток.

Используют культуру трипсинизированных клеток 10-11 дневных куриных эмбрионов в 1-1,5 л матрицах. Клетки выращивают на среде 199 или Игла с добавлением 10% бычьей сыворотки. Концентрация клеток при посадке 400-450 тыс./мл. Монослой формируется через 24-48 час. Качество культуры оценивают макро- и микроскопически. Перед заражением среду удаляют, отмывают монослой раствором Хэнкса или Игла и вносят в матрац содержимое одной ампулы исходного вируса, растворенное в 2 мл среды 199 или Игла, распределяют его по монослою покачиванием. Адсорбцию вируса ведут 1 час при комнатной температуре, вносят поддерживающую среду 199 или Игла с антибиотиками (100 ед./мл) на 1 л матрац 80 мл, на 1,5 л матрац 100 мл. Зараженные культуры инкубируют при 37^oC до наступления полной специфической дегенерации (обычно 48-72 ч). Матрицы трижды замораживают и оттаивают, вируссодержащую жидкость собирают, фасуют и хранят при -20^oC.

Приготовление посевного вируса в культуре клеток.

Осуществляют по описанной выше методике, матрацы заражают маточным вирусом.

Получение полуфабриката вакцины. 2000 мл вируссодержащей культуральной жидкости с концентрацией НВs Ag 600 нг/мл подвергают осветлению и концентрированию как в примере 1. Получают 500 мл полуфабриката вакцины, содержащего 1500 нг/мл НВs Ag и не содержащего вируса оспо-вакцины (по данным РНГА и определения инфекционной активности на хорианаллантоистой оболочке куриных эмбрионов).Иммунноаффинную очистку и приготовление вакцинного препарата проводят аналогично примеру 1.Получают препарат объемом 27 мл,который содержит 26,9 мкг/мл HBs Ag. В препарат добавляют стерильно гидроокись алюминия до 1% и суспензию разводят стерильно физраствором до 72 мл. Из полученного раствора отбирают аликвоты (объемом 3 мл) на анализ,остальное разливают в ампулы. Вакцинная партия содержит 10 мкг/мл HBs Ag, содержание белковых примесей не выше 5% Выход HBs Ag от исходного полуфабриката составляет 90%
Вакцинный препарат (конечный продукт) имеет следующие характеристики: иммунизирующая доза 1 мл; pH препарата 7,0-7,3;количество HBs Ag (10± 0,1) мкг/мл; содержание примесных белков не более 7% от общего количества белка; содержание гидроокиси алюминия не более 1% и мертиолата не более 1:10000 в конечной концентрации.

Препарат стерилен, неинфекционен, нетоксичен. Препарат способен индуцировать синтез антител у человека и животных.

Таким образом,предлагаемое решение обеспечивает получение высокоспецифического, безвредного и высокоочищенного препарата HBs Ag c более высоким выходом (75- 90%) по сравнению с более б лизким по сущности аналогом, где параметры составляют: выход до 67% и количество белковых примесей не ниже 10%
Кроме того, включение полученного указанным способом HBs Ag в качестве основы в субъединичную генноинженерную вакцину против гепатита В обеспечивает также снижение 50% иммунизирующей дозы вакцинного препарата ( по крайней мере, для беспородных белых мышей) до 200-250 нг, что 1,5-3 раза ниже, чем для вакцинных препаратов на основе HBs Ag из плазменного или дрожжевого сырья, а более высокая степень очистки от примесных белков обеспечивает низкую токсичность, безвредность и специфичность вакцины.

Предлагаемый способ получения вакцины может быть реализован в производстве вакцинных препаратов для профилактики гепатита В, а полученный в процессе приготовления вакцины высокоочищенный HBs Ag может быть использован для диагностики инфекции вирусом гепатита В.

Использование: медицина, в частности, вакцинное производство, для специфической профилактики гепатита В и для создания высокочувствительных диагностикумов для выявления инфекции вирусом гепатита В. Цель изобретения - повышение выхода и чистоты целевого продукта. Сущность изобретения : проводят накопление генно-инженерного НВs Ag в развивающихся куриных эмбрионах, которые заражают рекомбинантным посквирусом в аллантоисную полость, или в культуре клеток, выделяют и очищают НВs Ag путем мембранной фильтрации на каскаде мембран, размер пор одной из которых не превышает 0,15-0,22 мкм, и аффинной хроматографии на иммуносорбенте, в качестве которого используют иммобилизованные на СNBr активированной агарозе 4В поликлональные специфические антитела к НВs Ag с элюцией цитратно-фосфатным буфером pН 2,0-2,4 и 8 М мочевиной pН 2,0-4,2. Способ позволяет получать вакцинный препарат с выходом НBs Ag 80-90% и содержанием примесных белков до 5- 7%.

Способ получения субъединичной генно-инженерной вакцины против гепатита В, включающий накопление генно-инженерного поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), выделение и очистку HBsAg, отличающийся тем, что для накопления HBsAg используют развивающиеся куриные эмбрионы, которые заражают рекомбинантным поксвирусом непосредственно в аллантоисную полость, или культуру клеток, а выделение и очистку HBsAg осуществляют последовательно методом мембранной фильтрации на каскаде мембран, размер пор одной из которых не превышает 0,15 0,22 мкм, и аффинной хроматографией на иммуносорбенте, в качестве которого используют иммобилизованные на CNBr активированной агарозе 4В поликлональные специфические антитела к HBsAg, при этом элюцию осуществляют цитратно-фосфатным буфером рН 2,0 2,4 и 8М мочевиной рН 2,0 4,2.