СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ПРИ БЕЗНОИТИОЗЕ ЖИВОТНЫХ Советский патент 1973 года по МПК A61K39/02 

1

Изобретение относится к способам получения биологических препаратов, а именно нативных протозойных, гельмпнтозных антигенюв.

Известны способы получения антигенов из инвазионного материала, из которого путем ферментативного гидролиза получают очищенные цисты Besnoitia besnoiti с последующим шуттелированием, гомогенизированием и обезжириванием эфиром.

Однако этот способ очень продол кителен, трудно получать стандартный антиген.

Цель изобретения- получение стандартного и высокочувствительного антигена для серологических реакций при безноитиозе крупного рогатого скота, реакции связывания комплемента (РСК), реакции непрямой, гемагглютинации (РНГА), реакции преципитации в агаровом геле (РП-гель).

Предлагаемый способ позволяет получать стандартный антиген.

Способ осуществляют путем применения трех технологических этапов; извлечение и очистка цист В. besnoiti (исходного материала), дезинтеграция цист ультразвуком, изоионное фракционирование ультразвукового лизата.

П,исты безноитий получают лри помощн специальной среды (растворов с низким значением рН), которзю используют для механического извлечения цист из соединительной ткани крупного рогатого скота, пораженного безноитиозом, н окончательно очищают их от остатков структурных элементов ткани ферментативным перевариванием. Для получения антигена очищенные цисты дезинтегрируют ультразвуком, чтобы экстрагировать активное начало бензо 1тий, после чего из озвученной среды (лизата) путем нзононного фракционирования (осаждения в изоэлектрпческой точке) выделяют основную антигенную фракцию, свободную от неспецифических балластных веществ.

Помимо безноитиозного антигена способ позволяет получать токсоплазме ный, финнозный, цистицеркозный, туберкулезный и бруцеллезный антигены.

Способ приготовления антигена заключается в следующем.

Реактивы и растворы:

1.Натрий хлористый х. ч.

2.Калий тетраоксалат х. ч.

3.Соляная кислота х. ч.

4.Едкий натр х. ч.

5.Пепсин

6.0,85%-НЫЙ раствор хлористого натрия (физнологическИ|й раствор).

7.0,1 н. раствор соляной кислоты на физиологическом растворе хлористого натрия.

Извлечение и очистка цист В. besnoiti. 3- 5 г фарша соединительной ткани, пораженной цистами безноитий, дополнительно измельчают ножницами, переносят в сосуд размельчителя тканей, заливают 300-400 мл 0,05 М раствора тетраоксалата калия ва физиологическом растворе хлористого натриЯ (раствор 8) и гомогенизируют 5-7 мин. Полученную смесь центрифугируют при 1000- 1500 об/мин в течение 1-2 мин. Надосадочную жидкость, содержащую мукополисахариды, удаляют с помощью водоструйного насоса. Осадок ресуспендируют в 300-400 мл 0,05 М раствора тетраоксалата калия на физиологическом растворе и переносят в сосуд размельчителя тканей. Снова гомогенизируют 5-7 мин, смесь центрифугируют при том же режиме с последующим удалением надосадочной жидкости. Эту процедуру повтор.яют 3-5 раз до полной прозрачности надосадочной жидкости. После этого осадок, содержащий цисты, переносят в химическую колбочку с 50-400 мл 0,5%-ного раствора пепсина на 0,05 М раствора тетраоксалата калия с 0,85% хлористого натрия (раствор 9) и ставят в термостат при 37° С. Через каждые 1 - 2 час из ферментативной смеси пастеровской пипеткой на предметное стекло наносят каплю пробы для микроскопического контроля очистки ци.ст. Цисты микроскопируют под малым увеличением микроскопа. Ферментативное переваривание ведут до полного освобождения цист от остатков коллагеновых и мыщечных волокон (в среднем 4-6 час). После окончания переваривания цисты 2-3 раза отмывают на микроразмельчителе тканей, гомогенизированием в 50 мл 0,05 М рлствора тетраоксалата калия на физиологическом растворе хлористого натрия (раствор 8) в течение 2-3 мин. В осадке находятся извлеченные и очищенные от остатков тканей цисты безноитий.

Очищенные цисты используют для изготовления антигена непосредственно после получения или хранят в физиологическом растворе хлористого цатрия (раствор 6) с добавле нием мертиолата 1 : 10000 при 4° С.

Дезинтеграция цист В. besnoiti. Дезинтеграцию проводят в .специальном сосуде с водяным охлаждением для предотвращения нагреванйя озвучиваемой среды. В сосуд вносят 2-3 г (по сырому весу) очищенных цист безноитий и заливают 50-100 мл 0,1 и. раствора соляной кислоты на физиологическом растворе хлори.стого натрия (раствор 7).

Дезинтеграцию осуществляют с помощью УЗДН-1 воздействием ультразвуковых .волн частотой 22-35 кгц/сек в течение 45-90 мин (в зависимости от степени очистки цист) до просветления обрабатываемой среды.

Озвученная среда представляет собой беловато-сероватую жидкость с небольшим количеством осадка, состоящего из крупных взвещенвых части.ц, осколков оболочек цист и отдельных неразрушенных цист безноитий.

Осадок отделяют от жидкой части центрифугированием в течение 15-20 мин при 8000- 10000 об:/мин и затем растворяют в 20-30 мл дистиллированной воды при рН, равном

9-10, и температуре 35-40° С. Нерастворивщуюся часть осадка удаляют центрифугированием при том же режиме.

Из надосадочной жидкости (А) и растворенного осадка (Б) изоионны.м фракционированием выделяют специфическую антигенную фракцию.

Выделение антигенной фракции из надосадочной жидкости (А). Надосадочная жидкость является основным материалом для получения безноитиозного антигена. Эту антигевную фракцию выделяют медленной нейтрализацией (изменением рН) надосадочной жидкостн растворами едкого натра. Для этих целей используют 15, 10, 5 и 2,5%-ные растворы едкого натра. Пр,и усредиении надосадочной ЖИдкости в Пределах рН от 3,5 до 5,5 выпадает обильный, осадок. Формирование осадка происходит быстро и полно (крупными хлопьями) в изоэлектри.ческой точке при

рН, равном 4, и температуре 35-40° С.

Эту специфическую антигенную фракцию (фракция 1) отделяют от жидкой части центрифугированием в течение 15-20 мин при 8000-10000 об/мин. Если надосадочную жидкость подвергвуть дальнейшему подщелачиванию, то в пределах рН 9,0-10,5 может произойти выпадение незначительного количества второго осадка (фракция 2). Выпадение этого осадка прежде всего зависит от количества цист, взятых для дезинтеграции, их качества, полвоты разрущения (дезинтеграции), точного установления изоэлектрической точки (рН 9,6) и температуры (35-40° С). После центрифугирования и отделения вто

рого осадка (при 8000-10000 об/мин в течение 15-20 мин) Надосадочная жидкость еще содержит вещества, дающие слабую положи тельную реакцию на белок с реактивом Фолина, которые однако нельзя осадить в изо

электрической точке без предварительного концентрирования надосадочной жидкости (фракци;Я 3).

Исходя из того, что из трех фракций основ ной (серологически высокоактивной и специ

фической) является фракция 1, весь процесс выделения из надосадочной жидкости антигенной фракции практически сводится к осаждению только фракции 1. Выделение -антигенной фракции из растворечного осадка озвученной среды (Б). Из осадка озвученной среды, суспензированного в 20-30 мл дистиллированной воды, медленной нейтрализацией 10, 5 и 2,5%-нымИ растворами соляной кислоты при рН 3,5-5,5

(изоэлектрическая точка рН-4) и температуре 35-40° С осаждают антигенную фракцию, которая тождественна основной антигенной фракции 1 из надосадочной жидкости озвученной среды. Эту фракцию отделяют от

жидкой части центрифугированием в течение

15-20 мин при 8000-10000 и соединяют с ранее полученной фракцией 1. Надосадочную жидкость, содержащую балластные вещества отбрасывают.

Приготовление безноитиозного антигена. Осадки антигенной фракции с изоэлектрической точкой рН-4, выделенные из надосадочной жидкости (А) и осадка озвученной среды (Б), трехкратно промывают в дистиллированной воде центрифугированием при 8000- 10000 об/мин в течение Ю-15 мин и затем растворяют в предельно малом объеме подщелаченной дистиллированной воды (30- 50 мл при рН 9,0-9,5 и температуре 35- 40° С. Этот раствор является безноитиозным антигеном.

Приготовленный таким образом безноитиозный антиген не обладает антикомплементарными свойствами. Он проявляет высокую активность и специфичность в реакции связывания комплемента и других серологических реакциях. Хорошая растворимость антигена в дистиллированной воде позволяет различные серии этого препарата стандартизировать по содержанию белка.

Для длительного хранения безноитиозный антиген консервируют мертиолатом (1 : 10000) и стабилизируют очищенной желатиной или лиофилизируют в защитной среде.

Предмет изобретения

Способ получения антигена для серологических реакций при безноитнозе животных, включающий извлечение и очистку цист Besnoitia besnoiti, отличающийся тем, что, с целью стандартизации антигена, цисты дези.нтегрируют ультразвуком, после чего проводят вЕ,1деленне акт.вной и специфической фракции путем изоиониого фракционирован ия.