Способ дезинтеграции микроорганизмов для получения коклюшного антигена Советский патент 1982 года по МПК A61K39/00 

(54) СПОСОБ ДЕЗИНТЕГРАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КОКЛЮШНОГО АНТИгеНА

Изобретение отисюится к медицине и касается способа дезинтеграции микроорганизмов для получения антигенов. Известен способ дезинтеграции микро организмов для получения коклюшного антигена путем обработки суспензии микроорганизмов ультразвуком в статическом режиме с последующим отделением надосадочной жидкости tl . Однако известный способ не обеспечи вает высокой серологической активности антигена. Целью изобретения является повышени серологической активности антигена. Эта цель достигается тем, что соглас но способу дезинтеграции микроорганизмов для получения коклкяиного антигена путем обработки суспензии микроорганиз мов ультразвуком с послерующнм отделением надосадочной жидкости, обработку ультразвуком проводят при непрерывном движении суспензии в замкнутой системе при частоте 42-5О кГц и амплитуде 60-8О мкм в течение 13-18 мин. ; Способ осуществляют следующим образом. Для получения антигена используют коклкяцные микробы штамма 222, которые выращивают на казеиново-угольном агаре (среде КУА) при + 72 ч. Выращенные микроорганизмы собирают с питательной среды стеклянным щпате лем и суспендируют в стерильном физио логическом растворе рН 7,О-7,2, доводят концентрацию микробной взвеси до 15-10 микробных тел в 1,0 мл. Дезинтеграцию коклюшных микробов в данной концентрации проводят 13-18 мин в циркулирующей системе с частотой ультразвуковых колебаний 44 кГц, амплитудой 70 мкм. В результате ультразвуковой обработки взвеси происходит разрушение клеток микроорганизмов ц вьщеление в раствор антигенных комплексов. Полученная центрифугированием при 18,ОООоб7мин в течение 60 мин надосадочная жидкость представляет антигенный комп« леке, является цельным продуктом и собираегся в стерильный сосуд. Для более полного вьщеления коклюшного антигенного комплекса микробные остатки вновь ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе, помещают в камеру для ультразвуковой обработки и вновь двух - трехкратно повторянл- дезинтеграции 4-6 мин, каждый раз отделяя антигенный комплекс центрифугированием при 18,000 об./мин в течение 60 мин при + . На чертеже изображена установка для реализации предлагаемого способа, обший вид. Установка содержит ультр 1звуковой генератор 1, акустический концентратор 2, камеру 3 для обработки микробной взвеси, систему 4 трубопровода, кран 5 для слива дезинтегратора, пульсонасос 6, центрифугу 7 (ЦЛР-1). Установка работает следующим образом. Приготовленную бактериальную взвесь заливают в камеру 3, акустический концентратор 2 помещают в верхнюю часть камеры 3, включают генератор 1, обеспе чивающий получение ультразвуковых коле баний частотой 44кГц, амплитудой7О мкм и одновременно включается в сеть пульсо насос 6. Взвесь под действием пульсонасоса 6 циркулирует по системе 4 трубопровода, попадая в камеру 3„ подверга- ется ультразвуковой дезинтеграции. Посл обработки 13-18 мин пульсонасос 6 и генератор 1 отключают, дезинтеграт сли вают через кран 5, помещактг в центрифугу 7 и центрифугируют при 18,ООО об/ми 6О мин при +5 С. Надосадочную жидкость представляющую собой вьщеленный. антигенньй комплекс, сливают, а микробные остатки вновь ресуспендируют в первоначальном объеме физиологического раство ра, помегцают в камеру 3 и повторяют цикл дезинтеграции 2-3 раза в течени 4-6 мин, каждый раз отделяя антигенный комплекс центрифугированием. Пример. Культуру SordeteOea pertussis, щтамм 222, выращивают на казеиново-угольном агаре (среда КУА) при + 72. ч. Выращенные микроор ганизмы собирают с питательной среды стеклянным щпателем и суспендируют в стерильном физиологическом растворе рН 7,0 - 7,2, доводят концентрацию микробной взвеси до 1510 микробных тел в 1,0 мл по оптическому стандарту мутности Государственного контрольного института медицинских и биологических н паратов им. Л. А. Тарасевича. 50 мл приготовлейной микробной взвеси заливают в камеру 3, акустический концентратор 2 помещают в верхнюю часть камеры 3, включают генератор 1, обеспечивающий получение ультразвуковых колебаний частотой 44 кГц, амплитудой 70 мкм и одновременно включают в сеть пульсонасос 6. Взвесь под действием пульсонасоса 6 иркулирует по системе 4 трубопровода, и, попав в камеру 3, подвергается ультразвуковой дезинтеграции. После дезинтеграции 15 мин пульсонасос 6 и генератор 1 отключают, дезинтегратор сливакгг через кран 5, помещают в центрифугу 7 и центрифугируют при 18,ООО об./мин 6О мин при + 5 С. Надосадочную жидкость, представляющую собой выделенньй антигенный комплекс, сливают, а микробные остатки вновь ресуспендируют в перивоначальном объеме физиологического раствора, помещают в камеру 3 и повторяют цикл дезинтеграции 2 раза в течение 5 мин, каждый раз отделяя центрифугированием антигенный комплекс. Контрольную (неозвученную) и опытные (после воздействия ультразвука) микробные взвеси исследуют в реакции агглюти- нации с коклюшными аг глютинирующими сыворотками, полученными из Института эпидемиологии и микробиологии им. почетного акад. Н. Ф. Гамалеи, определяют количество разрушенных коклюшных бактерий методом сравнения со стандартом мутности. Выделенные при центрифугировании антизгены исследуют в различных серологических реакциях. Специфическая активность коклюшных антигенных комплексов изучается в реакции пассивной гемагглю- тинации (РПГА) паралпельно с реакцией торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА), в реакции двойной диффузии в геле по Оухтерлони и в иммуноэлекТрофорезе по П. Грабару в модификации В. С. Цветкова, количества белка в них определяется по методу Лоури и на спектрофотометре Spectrornein202 при длине волны 28О Нм. Сравинтельные данные серологической активности антигенов приведены в таблице.

Исследования оптической плотности контрольных и опытных суспензий коклюшных микробов показывают, что под действием ультразвуковых волн происходит дезинтеграция микроорганизмов, степень 25 которой возрастает с увеличением крат ности воздействия ультразвука.

Исследования по выделению количества гемагглютинирующих единиц активности (ГЕ) из 1 млрд. микробных клеток, пока 30 зывают, что известный способ позволяет вьщелить 27 ГЕ антигенной активности, тогда как способ по изобретению 94 ГЕ.

Использование изобретения позволяет jj повысить серологическую активность антигена и его выход.

20

Формула изобретения

Способ дезинтеграции микроорганизмов для получения коклюшного антигена путем обработки суспензии микроорганизмов ультразвуком с последующим отделением надосадочной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повьш1ения серологической активности антигена, обработку ультразвуком проводят при йепрерывном движении суспензии в замкнутой системе при частоте 42-50 кГц при амплитуде 60-8О мкм в течение 13-18 мин.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР № 571271, 1СЛ. А 61 К 39/ОО, 1975.

Продунт

f