СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ПРОТЕАЗЫ Советский патент 1973 года по МПК C12N9/62 

1

Изобретение относится к ферментной промышленности, в частности к получению щелочной протеазы.

Известен способ получения щелочной протеазы путем выращивания ее продуцентов - плесневых грибов рода Aspergillus на питательной среде, содержащей .источники углерода, азота и минеральные соли.

Предлагаемый способ -позволяет получить более активную щелочную протеазу.

Согласно изобретению в качестве продуцента протеазы используют штамм Aspergillus ochraceus № 1079.

Штамм Aspergillus ochraceus № 1079 зарегистрирован в институте Микробиологии и экспериментальной терапии в Иене под № I МЕТ РА 126.

Способ получения щелочной протеазы заключается в двухстадийном культивировании указанного штамма на питательной среде, содержащей источники углерода - оттек глюкозы и лактозу, источник азота - соевую муку, при температуре 20-30°С, преимущественно 25°С, при аэрировании и перемешивании среды.

Посевным материалом служат высушенные методом сублимации споры на обезжиренном молоке, хранившиеся при температуре + 4°С.

Вначале сухими спорами засевают скошенный агар, а затем пересевают на стерильное просо при температуре 25°С для их размножения и обогащения.

Первая стадия КЗльтивирования состоит в ее предварительном выращивании в течение 48 час -при температуре 25°С, при этом засевают спор на 1 мл питательной среды.

Затем 10% предварительно выращенной культуры переводят на вторую стадию культивирования и вновь выращивают при температуре 25°С. Питательная среда как на второй, так и на первой стадиях культивирования, может содержать в изменяющихся количествах картофельный крахмал, сухую крахмальную патоку, набухшую целлюлозу, оттек глюкозы, техническую лактозу, соевую муку, жидкий кукурузный экстракт, дрожжевой автолизат, мясной отвар, пептон.

При культивировании осуществляют контроль значения рН среды, восстанавливающих веществ, активности синтезируемой протеазы.

Активность протеазы определяют по модифицирован методу Кунитца. В качестве субстрата используют казеин.

2,9 мл буферного раствора Бриттона-Робинзона с рН 6,0 .и 0,1 мл культурального фильтрата выдерживают в термостате с 3,0 мл

раствора казеина при 37°С в течение 30 мин.

Затем нерасндеплелный казеин оеаждают добавлением 3,0 мл 10%-ной трихлоруксуеной кислоты и отделяют центрифугированием.

Экстинцию не растворимых в трихлоруксуеной кислоте продуктов расщепления измеряют при 280 нм ia спектрофотометре «Спектром он.

Таким же образом готовят слепую пробу (без инкубационного периода), а затем производят расчет.

Данные о рН-активности протеазы и ее стабильности (через 3 час) приведены на фиг. 1 и 2.

Пример 1. Первая стадия - предварительное культивирование. В широкогорлую колбу Эрленмейера объемом 500 мл наливают 100 мл питательной среды, содержащей 5% декстрозы из оттека глюкозы, 3% жидкого кукурузного экстракта, 0,5% СаСОз, 0,3% (NH4)SO.i, и .водопроводную воду - до 100 .мл.

Среду стерилизуют, засевают спорами щтамма Aspergillus ochraceus № 1079/1 MET PA 126 в количестве 10 на 1 мл и культивируют при 25°С в течение 48 час при взбалтывании на ротационной вибрационной мащине.

Па второй стадии культивирования в качалочные колбы лаливают по 100 льг (питательной среды, содержащей 1% технической лактозы, 4% декстрозы из оттека глюкозы, 1,5% соевой муки, 0,05% КС1, 0,05% Мд5О4-7П2О, 0,1% КПаРО, 0,ООГ% FeS047H2O, и водопроводную воду - до 100 мл, и стерилизуют. Затем эту среду засевают 10% культуры, полученной на первой стадии, и культивируют при 25°С.

Величина рН среды при этом повышается с 4,7 до 6,6.

На седьмые сутки кз.льти:вирования активность протеазы в культуральном фильтрате равна 7 СЕ на 1 мл.

Пример 2. Первую стадию - предварительное культивирование осуществляют на питательной среде, содержащей 5% декстрозы из оттека глюкозы, 3% жидкого кукурузного .экстракта, 0,5% СаСОз, 0,3 (Nn4)S64, 0,1% пеногасителя, и водопроводную воду - до 40 л.

Стерильную среду (стерилизация при 120°С в течепие 60 мин) засевают спорами щтамма Aspergillus ochraceus № 1079/1 MET PA 126 в количестве 5-10 спор на 1 л питательной

среды и культивируют при аэрации воздухом в количестве 0,5 л/мин на 1 л среды, перемещивая со скоростью 300 об1мин в течение 48 час при 25°С. При этом величина рП среды повышается с 5,0 до 6,0.

Полученную таким образом предварительную культуру пересевают в такую же среду, как описана в примере 1.

Па четвертые сутки культивирования активность протеазы в культуральном фильтрате составляет 3,5 СЕ на 1 мл.

Пример 3. Опыт осуществляют так же, как описано в примере 1, но на питательной среде, содержащей 0,1% КН2Р04, 0,05%КС1, 0,05% MgS04-7n2O, 0,01% Ре504-7П20, 4% сахара-сырца, 1% соевой муки, 0,5% картофельного крахмала, 0,1% пептоиа.

При этом величина рН повышается с 5,0 до 8,0. Па седьмой день культивирования в культурально.м фильтрате определяется активность протеазы - 4,4 СЕ на 1 мл.

Характеристика штамма Штамм Aspergillus ochraceus № 1079 определен по ТНОМ и Raper-критериям.

(I МЕТ РА-126)

Морфология. Штамм выращен на агаре по Чапек-Доксу с вариантом по Тому.

Инкубационная температура 24°С. Период выращивания 9 дней.

Пооитель конидий неразделенный.

Размер 344,5-809,9X4,48-9,94 мк.

Пузыри (в е с т и к у л а).

По большей части круглые, частично эллиптические.

Продольная ось 17,92-39,68 мк, поперечная 12,80-32,90 л/с.

С те ритмы. В две серии: первая серия размером 4,80-10,56X0,96 мк; вторая серия размером 6,08-8,37X1,28 ж/с.

Споры. Чаще круглые, частично овальные,

но овальные споры не очень сдвинуты в длину.

Круглые споры имеют диаметр 2,40-2,90 мк,

длина продольной оси овальных спор 1,92-

3,24 мк.

Дефис. Частично септирован, имеются включения. Размер отдельных клеток 9,39Х Х0,35-2,0 мк.

В таблице приведены результаты испытаний щтамма Asipergillus ochraceus № 1079 по отнощению к различным веществам, испытанным на пористых пластиках, 9-дневная культура.

Предмет изобретения

Способ получения щелочной протеазы путем выращивания ее продуцентов - плесневых грибов рода Aspergillus на питательной

среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, отличающийся тем, что, с целью получения более активной протеазы, в качестве продуцента используют штамм Aspergillus ochraceus № 1079.

т.

Л7

0 s:

56 783 WpH Фиг.1

100

ei.

50

a

I

5678

WpH Фиг. 2