Штамм @ @ ВУД @ -2 N @ 203-продуцент амилолитических ферментов,используемых для осахаривания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта и способ получения амилолитических ферментов для осахаривания Советский патент 1985 года по МПК C12N15/00 C12N9/34 C12R1/665 

Изобретение относится к микробиологической и спиртовой промышленности и касается нового штамма-продуцен та амилолитических ферментов и способа получения амилолитических фёрментов для осахаривания. Известны штаммы грибов из рода Aspergillus - продуценты амилолитических .ферментов lj . Из известных штаммов наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является термостабильный штамм Aspergillus awarao ri Т-1 № 464 - продуцент амилолитических ферментов zl , Существенным недостатком известно го штамма является невысокая активность глюкоамилазы - 45-50 ед/мл и отсутствие других ферментов, необходимых для осахаривания. Известен способ получения амилолитических ферментов, используемых для осахаривания крахмалсодержащего сьтрья при производстве спирта, преду сматривающий выращивание посевного материала, приготовление питательной среды, культивирование продуцентов на питательной среде,, содержащей гид ролизат кукурузной муки 3j . Недостатком этого способа является длительность процесса получения ферментов. Известен также способ культивиройания Aspergillus awamori - 466 на питательной среде, содержащей гидролизованную солодом или альфа-амилазой кукурузную муку и в качестве ста билизатора рН доломитовую муку в количестве 1,5-3,0%. Активность амилолитических ферментов через 120-130 ч ферментации соответственно глюкоамилазы - 160 ед/мл, а ct амилазы 45 ед/мл. Способ обеспечивает выход спирта 65,5 дал/т усл. крахмала {4. Недостатком способа является неспособность штамма-продуцента синтезировать комплекс ферментов, содержа щий помимо амилолитических ферментов целлюпазы и протеазы, необходимые для эффективного осахаривания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта, а также неустойчивость продуцента к повьш1енным температурам Из известных способов наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту явля ется способ получения амилолитических ферментов для осахаривания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта, предусматривающий вьфащивание продуцента Aspergillus awamori на. питательной среде, содержащей крахмал, азотнокислый натрий, однозамещенный фосфорнокислый калий, сернокислое железо и солодовые ростки, приготовление производственной питательной среды путем гидролиза кукурузной муки солодом или бактериальнойoi-амилазой, разваривание, вакуум-охлаждение, посев культуры продуцента, ферментацию и введение диаммонийфосфата двумя дозами соответственно в гидролизованную кукурузную муку перед инокуляцией посевного материала с последующей стерилизацией и повторно - в процессе ферментации 5 . Известный способ,хотя и обеспечивает получение препарата с высокой глюкоамилазной активностью, однако содержит лишь следы ot-амилазы (до 4 ед/мб), что требует при осахаривании введения дополнительньк источников о(,-амилазы. Целью изобретения в части штамма является получение термостабильного штамма - продуцента амилолитических ферментов, продуцирующего комплекс ферментов, необходимых для осахаривания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта. Цель достигается тем, что в качестве продуцента амилолитических ферментов используется термостабильный штамм Aspergillus awamori ВУД Т-2. Штамм зарегистрирован в коллекции Музея промьшшенных культур микроорганизмов ВНИИ Генетика.; коллекционный номер F 203. Штамм Aspergillus awamori ВУД Т-2 № F 203 получен в результате двухступенчатой селекции исходного штамма Т-1. На первом этапе конидии обрабатывали химическим мутагеном-этиленимином в концентрации 1:1000 в течение 1 ч с последующим рассевом на среду Чапека с высокой концентрацией крахмала (6-8%). На втором этапе применен метод поддерживающей селекции с целью выбора и сохранения наиболее активного продуцента Aspergillus awamori ВУД Т-2 N-F 203. Диаметр колонии на 5 сут 20-24 мм, зона гидролиза крахмала 10-15 мм. Конидии круглые с шипами.

На среде с мальтозой характеристика колонии аналогична предьщущей. Диаметр колонии 25-27 мм, конидиеобразование менее плотное.

На сахарозе - колония круглая, слабо скаладчатая, с обильным образованием конидий по всей поверхности. Центр колонии плоский, темно-коричневый с оливковым оттенком. В среду вьщеляется коричнево-красный пигмент Размер колоний 18-20 мм.

На лактозе - колония круглая, плоская с очень слабым конидиеобразованием по всей поверхности колонии. Споры светло-коричневые. В среду выделяется слабо розовый пигмент. Размер колонии 10-15 мм.

Отношение к источникам углерода:

культура гидролизует К1захмал, дикстрины, мальтозу, паннрзу, изомальтозу, сахарозу с образованием глюкозы. Потребляет без выделения газа глюкозу, маннит, сорбит. Слабо растет на лактозе и ксилозе.

Отношение к источникам азота:

культура хорошо ассимилирует аммонийные соли органических кислот, нитраты. Потребляет мочевину, аспарагин, пептон, каз.еин, аминокислоты.

Температурный оптимум роста штамма 35-40°С. Развивается при концентШтамм-продуцент

рации водородных ионов от 2,8-8,0. Азроб. Не обладает токсическими свойствами.

Для проверки ферментативной активности предлагаемого штамма ВУД 1-2 № F 203 проводят опыты по глубинному культивированию его в качалочных колбах вместимостью 750 мл со 100 мл питательной среды на качалке, делающей 200-230. об/мин.

Для биосинтеза глюкоамилазы использовали питательную среду следующего состава, мас.%:

6,0

Крахмал картофельный 0,91

NaNO 0,1

0,05

КС1 0,05

MgS04 0,001

ГеЗОд 3,0

Солодовые ростки

Вода Остальное.

Вьфащивание осуществляют в течение 72 ч при 35-40с. Глюкоамилазную активность определяли по ГОСТ 20264. 4-74. Штамм синтезировал наряду с глюкоамилазой протеазу, амилазу, целлюлазу и липоксигеназу.

Сравнение активностей предлагаемого штамма и прототипа приведены в табл. 1.,

Таблица 1

Активность, ед/мл

1. Штамм Aspergilltis awamori ВУД Т-2 (коллекция Музея промьшшенных кольтур микроорганизмов ВНИИ Генетика, коллекционный № F 203) продуцент амилолитических ферментов, используемых для осахаривания крах- малсодержащего сырья при производстве спирта. 2. Способ получения амилолитических ферментов для осахаривания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта, предусматривающий выращивание посевного материала продуцента Aspergillus awamori, ириготрвление производственной питательной среды путем гидролиза кукурузной муки солодом или бактериальной об-амилазой, разваривание, вакуум-охлаждение; посев культуры продуцента, ферментацию, а также введение диаммонийфосфата двумя дозами соответственно в гидролизованную кукурузную муку перед инокуляцией посевным материалом с последующей стерилизацией и повторно в (Л процессе ферментации, о т л ич а ющ и и с я тем, что, с целью сокращес: ния сроков культивирования продуцента, повышения активности ферментов и получения наряду с амилолитическими ферментами целлюлозы и протеазы, необходимых для осакаривания при производстве спирта, в качестве проду цента используют штамм Aspergillus о awamori ВУД Т-2 № F 203, а в питасо тельную среду двумя дозами в соотно«lib шении .3:1- вводят в качестве стабилиС затора рН углекислый калыщй или ломитовую муку в количестве от 1 до Ф 10%, причем большую дозу вносят на стадии получения посевного материала в инокулятор, а меньшую - на стадии ферментации по истечении 20-24 ч от начала процесса совместно с диа 5монийфосфатом. 3. СпЬсоб по п. 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что количество по- ; сёвного материала, вводимого на ферментацию, устанавливают равным 3-10%.

ГлА

Прототип Asp. awamori Предлагаемьй Asp. awamori № F 203 Из табл 1 видно, что глюкоамилазная активность предлагаемого штамма превышает активность прототипа на полусинтетической среде в 1,5-2 раза (60-100%). Кроме того, предлагавмый продуцент синтезирует другие .ферменты:об-амилазу, протеазу, целлю лазу и липоксигеназу.

Сх

ПС

0,1-0,2

1,5-3,0 0,5-1,0 2-4

20-25 Целью изобретения в части способа является сокращение сроков культивирования продуцента, повышение активности ферментов иполучение наряду с амилолитическими ферментами целлют.зы и протеазы, необходимых для осахаривания крахмалсодержащего сьфья при производстве спирта. S1 Цель достигается тем, что при спо собе получения амилолитических ферме тов для осахаривания крахмалеодержащего сырья при производстве спирта, предусматривающем выращивание посевного материала продуцента Asp. awamo ri, приготовление производственной питательной среды путем гвдролиза: ку курузной муки солодом или бактериаль ной об-амилазой, разваривание, вакуум- охлалщение , посев культуры - продуцента, ферментацию, а также введение диаммонийфосфата двумя дозами соответственно в гидролизованную кукурузную муку перед инокуляцией посевным материалом с последующей стерилизацией и повторно - в процессе ферментации, в качестве продуцента используют щтамм Aspergillus awamori ВУД Т-2 № 203, а в питательную среДУ двумя дозами в соотнощении 3:1 вводят в качестве стабилизатора рН углекислый кальций или доломитовую муку в количестве от 1 до 10%, причем большую, дозу вносят на стадии получения посевного материала в инокулятор, а меньшую - на стадии фермента ции по истечении 20-24 ч от начала процесса совместно с диаммонийфосфатом. Согласно изобретению количество посевного материала, вводимого на ферментацию, устанавливают равным 3-10%. Предлагаемый способ получения амилолитических ферментных препаратов для осахаривания крахмалсодержащего сырья заключается в следующем. Посев ной материал в колбах готовят на жид кой питательной среде, содержащей картофельный крахмал, азотнокислый натрий, фосфорнокислый калий, сернокислый магний, хлористый калий, сернокислое железо и солодовые ростки. Вьфащивание осуществляют в течение 20-24 ч при 28-30с, Подготовленную жидкую посевную культуру; передают на стадию культивирования в инокулятор. Для культивирования посевной культуры в инокуляторе используется среда следующего состава, мас.%; Мука5-8 Кукурузный экстракт 1 Стабилизатор рН 0,75-7,5 Для ферментации в производственных условиях жидкую питательную среду готовят следующим образом. Куку узную муку смешивают с водой в. со6отношении 1:3, разваривают при 148154 С в течение 30-50 мин охлаждают до 60, С и осахаривают солодовым молоком или бактериальной о -амилазой в течение 30-40 мин при 58-60с. .Затем вводят диаммонийфосфат в количестве 0,2 мас.%, стерилизуют при 120-125°С в течение 30-40 мин и охлаждают до 35-40 С. После охлаждения в подготовленную ю питательную среду вводят посевной материал из инокулятора. Продолжительность кулитивированйя посевного материала в инокуляторе составляет 20-24 ч при 28-30°С, непрерывном перемешивании и аэрации стерильным воздухом. На стадию ферментации передают посевной материал в количестве 3-10% к объему среды. Ферментацию осуществляют при 3540 С, непрерывном перемешивании и аэрации стерильным воздухом (3040 м/M среды в 1 ч) . Через 20-24 ч от начала процесса ферментации в среду вводят оставшуюся часть диаммонийфосфата (0,1 мас.% к объему среды) совместно с оставшейся частью стабилизатора рН (0,25-2,5%). Продолжительность ферментации 120-130 ч. Готова я культура имеет следующую активность :.--глюкоамилаза 125 130 ед/мл, -амилаза 20-25 ед/мл, протеаза 0,5-1,0 ед/мл, целлюлаза 24 ед/мл. Выход спирта 65,8 дал/т условного крахмала. П р и м е р 1. Посевной материал spergillus awamori ВУД Т-2 № F 203 колбах выращивают на питательной реде следующего состава, мас,%: Крахмал картофельный 6,0 ,91 КНлРО 0,1 KCI, 0,05 ,05 FeS04 .0,01 Солодовые ростки .3,0 ВодаОстальное рН устанавливают равным 4,8. Выащивание осуществляют в течение 0 ч при 30°С. . Для культивированияв инокуляторе итательная среда содержит следующие омпоненты мас.%: Кукурузная мука 6,0 Кукурузный экстракт 1 Углекисльй кальций 0,75 Производственную среду готовят ледующим образом. Кукурузную муку мешивают с водой при 45°С в соотно 710 шении 1:3, полученную массу разваривают при 148°С в течение 30 мин. Разваренную массу охлаждают до 60 С, осахаривают солодовым молоком в течение 30 мин, вводят 0,2 мас.% диаммонийфосфата, стерилизуют при 120 С в течение 30 мин, охлаждают до 35°С и вводят посевной материал из инокулятора в количестве 10%, Ферментацию проводят при 35 С, давлении 0,03 МПа и аэрации стерильным воздухом в количестве 30-40 м/м среды в 1 ч при непрерывном перемешивании турбинной мешалкой с 150 об/мин. Через 24 ч после начала ферментации в среду вводят вновь диаммонийфосфат в количестве 0,1 мас.% и угле кислый кальций CaCO-j в количестве 0,28 мас.%. Продолжительность фермен тации составляет 130 ч. Активность ферментов составляет: глюкоамилаза 120 ед/мл, 06 -амилаза 20 ед/мл, протеаза 1 ед/мл, целлюпаза 2 ед/мл. Пример 2. Посевной материал готовят аналогично примеру 1 и произ водственную питательную среду .готовя аналогично примеру 1. Только на стадии приготовления посевного материала вводят стабилизатор рН. - доломито . вую муку в количестве 7,5 мас.% и диаммонийфосфат - 0,3%. Гидролиз (осахаривание) кукурузной муки прово дят бактериальной ix;-амилазой. Концен рацию сусла устанавливают 18 мас.% и проводят ферментацию. Ферментацию осуществляют на производственной сре де следующего состава, мас.%: Кукурузная мука25 ВодаОстальное. По истечении 24 ч от начала процесса ферментации в среду вводят 0, диаммонийфосфата и 2,5% доломитовой муки. Ферментацию ведут в течение 120 ч. Культура имеет следующую активность (ед/мл):Об-амилаза 30, глю коамилаза 130, протеза 0,5, целлюла за 1,2. П р и м 6 р 3. Посевной материал Aspergillus awamori ВУД Т-2 № F 203 в колбах выращивают на питательной среде следующего состава, мас.%4 Крахмал картофельный 6,0 KHjPOi 6 СоЛодовые ростки 3,0 ВодаОстальное. рН устанавливают равным 4,8. Выращивание осуществляют в течение 20 ч при 30 с. Для культивирования в инокуляторе питательная среда содержит следующие компоненты, мас.%: Кукурузная мука 6,0 Кукурузный экстракт 1,0 Углекислый кальций 3,75 Производственную среду готовят аналогично примеру 1 и вводят посевной материал из инокулятора в количестве 6%. Ферментацию проводит при35°С, давлении 0,03 МПа и аэрации стерильным воздухом в количестве 3040 среды B.I ч при непрерьгоном перемешивании турбинной мешалкой с 150 об/мин. Через 24 ч после начала ферментации в среду вводят вновь диаммонийфосфат в количестве 0,1 мас.%, углекислый кальций СаСОа в количестве 1,25 мас.%. Продол}| ительность ферментации составляет 130 ч. Активность ферментов составляет: глюкоамилаза 126 ед/мл, об-амилаза 22 ед/мл, протеаза 0,8 ед/мл, целлюлаза 3 ед/мл. Выход спирта 65,8 дал/т условного крахмала. Пример 4. Посевной материал и/производственную питательную среду готовят аналогично примеру 1, только вводят в количестве 3%. На стадии приготовления посевного материала вводят стабилизатор рН - доломитовую муку 5,25% и диаммонийфосфат 0,5%. Гидролиз (-осахаривание) кукурузной муки проводят бактериальной i-амилазой. Концентрацию сусла устанавливают 18 мас.% и проводят ферментадаю.Ферментацию осуществляют на производственной среде следующего состава, мас.%: кукурузная мука 25, вода - остзльнс э. По истечение 24 ч от начала продесса ферментации в среду вводят 0,2% диаммонийфосфата и 1,75% доломитовой муки. Ферментацию ведутв течение 120 ч. Культура имеет следующую активность, (ед/мл): ti6-амилаза 28, глюкоамилаза 128, протеаза 0,5, целлшггаза 1,6. Выход спирта 65,8 дал/т условного крахмала. Пример 5. Способ осуществля Сй.аналоги4но примеру 1, но стабилизр тор вводят в соответствии со способом-протртипом - один раз в производ- и цеЛлюлазы не рбнаруживает ственную среду перед стерилизацией ся,

в количестве 3%. Активность глюкоами- Преимущества способа по сравнению лазы 100 ед/мл. Активность протеазы с прототипом представлены в табл.2.

: 5 . . Таким образом, изобретение обеспечивает сокращение сроков культивирования продуцента, повьшение активноеТабли.ца 2 ти амилолитических ферментов и получение наряду с амилолитическими ферментами целлкшазы и протеазы.