Способ получения убихинона-9 Советский патент 1977 года по МПК C12D13/10 

1

Изобретение относится к микробиологической промышленности.

Известен способ получения убахинона-9 путем культивирования его продуцентов, отделения выращенной биомассы и омыления. ее с последующим вьщеленнем убихинона-9 из неомыленной фракции.

Целью изобретения является одновременное получение наряду с убахяноном-9 био- шрота.

Достигается это тем, что перед омылеBtieM биомассу высушивают, затем экстрагируют с получением при этом биошрота и биолипидов, биошрот удаляют, а полученнные . биолипиды омыляют.

Кроме того, в качестве продуцентов убихнона-9 используют вид CandidflL yitEJjSfTHOtr.jJii, из которого берут штаммы НП--4, Н-542.

Предложенный способ осуществляют следующим образом.

Вначале культивируют продуценты убихннона-9. В качестве продуцентов используют культуру вида Candida g-uit ierrnondiiB виде штаммов и Н-542. Выращивание веду непрерьшным или периодическим способом

при интенсивном перемешивании и аэрировании среды воздухом.

В качестве источника углерода используют фракции парафиновых углеводородов, содержащие Н-алканы с 1О-24 атомами урлерода, а также нефтяные дистилляты, содержащие 1О-4О% комплексообразующнх углеводоролов.

Водную минеральную среду используют следующего состава: сульфат аммония, фосфорная кислота, хлористый калий, сернокислый магний и смесь микроэлементов.

Выращивание культуры вида Catldida guiCEterTnotidii проводят при интенсивном перемещиванни и аэрировании среды воздухом при рН 4-4,5 и температуре 28-36°С.

Биомассу из культуральной жидкости выделяют сепарированием и удаляют из не с помощью жирорастворителей(гексан, ацетон, петролейный эфир, экстракционный бензин) остаточные углеводороды, липиды и другие вещества. Твердую фракцию отделяют фильтрацией и высушивают под вакуумом, получая белково-витаминный концентрат-биошрот, который удаляют. Затем филь рат, содержащий растворитель и экстрагиру мые нм вещества, выпаривают под вакуумо при этомсухой остаток состоит из смеси липидов, стеролов, жирорастворимых витам нов и остаточных углеводородов. При этом убихинон, обладая липидными свойствами, также находится в этой смеси, которая в дальнейшем называется биожиром. Выход биожкра составляет 5-ЗО% от веса сухой биомассы. Убихинон содержится в биожире в количестве 0,05-0,2%. Выделение убихинона из биожира проводят в несколько стадий. Вначале биожир омыляют метанольным раствором едкого ка ли в присутствии пирогаллола при постоянном перемешивании при 90-100 С. Затем отделяют фракцию неомыленных липидов пу тем экстракции растворителем, причем в качестве последнего используют серный ил петрэлейный эфиры или гексан. Далее удаляют растворитель, экстракт сушат и из него содержащего неомыленные липиды, углеводороды н другие вещества, выделяют убихи НОИ путем хроматографии на окиси алюмини Убихинон выделяют кристаллизацией из абсолютного этанола; выход его составляет 60-70% от веса концентрата. П р и м ер 1. Культуру вида Ссспс/Ыс guiEEiernroTfdii НП-4 выращивают на среде следующего состава (г/л). ( NiU )РО КСЕ .ngr 6 ,25 NaCE0,00 6 Fe.,012 M-n so.0,012 Zrr 50.0,012 Очищенные жидкие парафины (С,о-С,4)10 Азот (в виде сернокислого аммония или аммиачной воды) 0,7 при рН 4,0-4,2 и температуре 32-36 С. Процесс ведут непрерывно в опытно-про мышленных ферментерах емкостью 750 м с аэрацией и перемешиванием при степени разбавления 0,15 . Полученную биомассу выделяют сепарац высушивают в распылительной сушилке и эк трагируют бензином. Выход биожира 5% от веса сухой биомассы. Далее проводят омыление, для чего п мещают 10 мл биожира в колбу, снабженную мешалкой и соединенную с холодильником, и приливают в него 20 мл 10%-нрго метанояьного раствора едкого кали, содержащего 0,2 г пирогалЪопа. Процесс омыления ведут в течение 30 мин при 90-1 . Неомыленную липидную фракцию извлекают, проводя трехкратную экстракцию по 50 мл серным эфиром. Эфирные экстракты сливают вместе, промывают водой до нейтральной реакции и отгоняют растворитель. Затем остаток из колбы переносят на колонку с окисью алюминия П степени по Брокману (размеры колонки, см: высота 15, диаметр 2, высота слоя окиси алюминия 10). Элюацию убихинона проводят смесью петролейного и серного эфиров (9:1), общий объем 300 мл. Содержащую убихинон фракцию отделяют в виде желто-оранжевой полосы. Элюат упаривают на роторном испарителе при 45-50 С и остаток взвешивают. Вес остатка 25 мг, содержание в нем.убихинона, определенное по модифицированному методу Кревена, 22 мг или 2,2 мг на 1 мл биожира. Затем для получения кристаллического препарата остаток растворяют в 0,5 мл абсолютного этанола и оставляют на сутки для криста/шизации при О С, причем после одной перекриста;и1изации выделяют 13 мг убихи- нона. npeiiaf)aT имеет с.чеаующую физико-химическую к;1 ;иктеп;1стику: температура 1и1цвлеиия 43,1,,4 С; эт(1иэ. (окисленный) 272 ,.. J 80; этанол (восстановленный) 2;;;О нм; J 5О,5; массс::октр ЛЛ 794; (М+2) 796; () 779; :.1,:-.д1 С г/е 235 и 1Э7Я,на тэнкослойных co;;,iK.ai о-левых пластинах в системе ацетонвода (95:5) 0,31; положение пятен соответствует кристаллическому препарату убихинока-9, используемого как метчик. На основании полученной физико-химической характеристики препарата установлено, что культура Candida uittiermon(3ii НП-4 при росте йа среде с очищенными жидкими парафинами синтезирует убихинон-9. П р и м е р 2. Культуру вида Cq-ndida иШ{еггпо-пвИ Н-542 выращивают на среде следующего состава (г/л): ( N Н) ,87 HjPO (70%-ная) 1,75 КС11,14 Mgr504-7H.,00,55 ,045 .O0,O31 .0,033 CL. SO4.-5H.jO0,OO4 В качестве источника углерода в среду добавляют нефтяной дистиллят из нефти Мангышлакского месторождения в количестве 15%, что соответствует 4% по содержанию комплексообразуюших углеводородов. Выращивание культуры проводят периодическим способом в ферментере емкостью 30 л при постоягнном перемешивании и аэрации. После сепарации и сушки получают 170 г биомассы, из которой путем экстракции бензином получают 28 мл биЪжира. Омы ление проводят таким же образом и при тех же УСЛОВИЯ.Х, как указано в примере 1. Затем экстракцию неомьшенной фракции проводят петролейным эфиром (фракция 40-6О°С), отгоняют растворитель и хроматографически на окиси алюминия вьщеляют кон центрат убихинона, который составляет 32 мг; содержание убихинона в концентрате, определенное по методу Кревена, состав ляет 27,5 мг. Таким образом, содержание убихинона в биожире, полученном из культур, выросших на среде с фракцией нефтяного дистиллята, составляет 1,1 мг/мл бножира. Из 25 мг концентрата после кристаллизации из абсолютного этанола получают 15 мг кристаллического препарата с температурой плавления 43,8-44,5 С. При хроматографическом анализе на селикагелевых пластинах в системе ацетонвода в соотношении 95:5 положение пятен выделенного препарата соответствует метчику Од и образцу убдхинона-9, вьщеленного из культур видаСа1 131Йо1ди1М- вгтопа11 КП-4. Пример 3. Культуры вида Cdndida g-ui 6ierynondii Н-452 выращивают на среде того же состава, что и в примере 2. Способ вы ращивания непрерывный, степень разбавле- ния среды 0,2 час при ЗО-32 С. Вьщеление биожи а проводят из сырых ультур путем экстракции ацетоном с послеующим переводом жирорастворимых компонентов в гексан. При этом из 170 г дрожжей при их влажности 81%, получают 7,5 г иожира. Омыление биожира, получение неомьшенной фракции и вьщеление из нее убихинона проводят так же, как в примере 1. После хроматографической очистки получают 10 мг концентрата, содержащего 6,96 мг убихинона. После кристаллизации нз абсолютного этанола выделяют 4,08 мг убихинона-9. Формула изобретения 1.Способ получения убихинона-9 путем культивирования его продуцентов, отделения выращенной биомассы, омыления ее с последующим вьшелением убихинона-9 из неомыланной фракции, отличаюш н и с я тем, что, с целью одновременного получения наряду с убихиноном-9 биошрота, перед омылением биомассу высушивают, затем экстрагируют с получением при этом-.биошрота и биолипидов, биошрот удаляют, а полученные биолипиды омыляют. 2.Способ по п,1, отличающийся тем, что в качестве продуцентов убихинона-9 используют вид Catidida g-oiECiep-motidii3.Способ по ПП.1 и 2, отличающий с я тем, что из вида Candida guittiertnonS i используют штаммы НП-4, Н-542.