Способ получения гидрогеназы Советский патент 1989 года по МПК C12N9/02 C12P7/66 

ME.

Изобретение относится к области промышленной микробиологии и может быть использовано в инженерной энзимиологии, биокатализе, медицине и в научных исследованиях при изучении биохимии процессов дыхания и фотосинтеза. Целью изобретения является повышение выхода и увеличение удельной активности гидрогеназы и удешевление процесса. При выделении гидрогеназы предлагается использовать предварительную обработку биомассы клеток бактерий охлажденным ацетатом, что позволяет значительно повысить выход гидрогеназы и одновременно получить биологически активные соединения: убихинон Q₈ и менахинон MQ₈. Окончательную очистку гидрогеназы проводят методом повторной хроматографии на фенилсефарозе CL- 4B, в результате чего резко возрастает степень очистки и удельная активность гидрогеназы. 1 табл.

1

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к микробиологическому синтезу биологически активных веществ, и может быть использовано в инженерной энзи- мологии для синтеза соединений, меченых изотопами водорода, в научных исследованиях для изучения процессов биокатализа и преобразования световой энергии в молекулярный водород.

Целью изобретения является повышение выхода, увеличение удельной активности гидрогеназы, расширение

2

технологических возможностей и удешевление процесса.

Изобретение позволяет одновременно с гидрогеназой получить биологически активные вещества: убихикон Q& и менахинон MOg.

Сущность изобретения заключается в том, что перед разрушением ультразвуком клетки бактерий обрабатывают охлажденным ацетоном, а после отделения ацетона и нерастворимого остатка клеток из растворимой фракции гид- рогеназу выделяют фракционированием

сульфатом аммония боч предпаритель- ной термообработки, очистку гидро- геназы проводят хроматографией на фенилсефарозе CL-4B, повторяя эту операцию дважды. Отдепенный ацетоно- иый экстракт упаривают и после омыления липиднон фракции из него выделяю убихинон Qa и менахинон MOg.

Предварительная обработка клеток бактерий охлажденным ацетоном позволяет извлечь каротиноиды, хлорофиллы липиды, хиноны и другие липофильные соединения, частично разрушить структуру мембран, повышает солюбилизацию белков, способствуя, тем самым, повышению выхода фермента.

При предварительной термообработке бесклеточного экстракта происходит денатурация термолабильных белков, которые, выпадая в осадок, соосаждают частично гидрогеназу, что уменьшает выход фермента. Если термообработку проводить после фракционирования сульфатом аммония, то устраняются сорбционные потери гидроге- назы и при предварительном фракционировании ( устраняется част белка, не обладающая ферментативной активностью, что способствует более полному выделению гидрогеназы.

Пример 1. Клетки Thiocapsa roseopercisina штамм BBS выращивают по известной методике в анаэробных условиях.

150 г сырых клеток суспендируют в 150 мл 0,02 Н кальцийфосфатном буфере (рН 7,0) с помощью магнитной мешалки в течение 1 ч. К полученной суспензии добавляют 1,5л охлажденного ацетона, перемешивают. Клетки отфильтровывают в воронке Бухнера под вакуумом и промывают 1 л охлажденног ацетона. Экстракты объединяют для получения убихинона Qg и менахинона MQg.

Клетки после обработки ацетоном высушивают под вакуумом и суспендируют в дистиллированной воде в соотношении 1:20, суспензию обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе в течение 30 мин при 22 кГц. Растворимую фракцию, содержащую гидрогеназу, отделяют центрифугированием в течение 30 мин при 5000 g.

К супернатанту добавляют до 30% насыщения сульфат аммония и выпавшие в осадок примесные белки и мембранные фракции клеток отделяют

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

центрифугированием в течение 60 мин при 5000 g. Для осаждения гидрогеназы концентрациюсульфата аммония увеличивают до 70% и суспензию центрифугируют в течение 15 мин при 5000 g. Осадок, содержащий гидрогеназу, растворяют в 150 мл 0,02 М калий- фосфатного буфера, рН 7,0 и полученный раствор прогревают в течение 10 мин при 70еС для удаления термо- либильных белков. Денатурированные белки осаждают центрифугированием в течение 30 мин при 5000 g и для дальнейшей очистки гидрогеназы су- пернатант наносят на колонку (1,5х х15 см) с фенилсефарозой CL-AB, уравновешенную 0,8 М раствором сульфата аммония в 0,02 М калийфосфатном буфере, рН 7,0. Колонку с адсорбированной на ней гидрогеназой промывают вначале 100 мл 0,8 М, а затем тем же объемом 0,2 М раствором сульфата аммония. Гидрогеназу элюируют дистиллированной водой до полной элюции и подвергают повторной хроматографии на колонке с фенилсефарозой CL-4B. Для более тонкой очистки фермент элюируют из колонки понижающимся градиентом концентрации раство- ра сульфата аммония объемом 100 мл в диапазоне 0,2-0,004М. Полученные по данной методике препараты гидрогеназы обладают высокой удельной активностью.

Характеристики гидрогеназы приведены в таблице.

Ацетоновый экстракт упаривают на роторном испарителе под вакуумом при 40-456С. К сухому остатку приливают смесь, состоящую из 200 мл 96%-ного этанола, 130 мп дистиллированной воды, 12,6 г КОН и 6 г пирогаллола, нагревают до кипения и проводят омыление в течение 25 мин в токе аргона. Смесь охлаждают на бане со льдом и проводят экстракцию хинонов из неомыленной фракции гекса- ном (3x100 мл). Гексан упаривают на роторном испарителе. Сухой красно- коричневый осадок растворяют в 3 мл смеси для элюции и хроматографируют на колонке с окисью алюминия. Элю- цию проводят смесью петролейный эфир (т.кип,40-70°С) - хлороформ - диэтиловый эфир в отношении 85:10:5.

Фракцию в виде ярко-желтой полосы с 1-Ц 0,7, содержащую менахинон, и фракцию в виде ярко-оранжевой по51

лосы г Rf 0,5, содержащую убихинон собирают отдепьно, упаривают и рехро матографируют на колонке с окисью алюминия в системе петролейный эфир- пиэтиленовый пфир - ледяная уксусная кислота в отношении 90:30:1. Элюат упаривают и определяют количество полученных препаратов спектрофото- метрически в абсолютном этаноле, используя соответствующие коэффициенты экстринкции.

Выход составляет, мг/г сухих клеток:

Гидрогеназа0,6

Убихинон Оа2,2

Менахинон К080,3

Преимущества предлагаемого способа по сравнению с известным заключаются в увеличении в три раза выхода фермента, значительном увеличении удельной активности и степени очистки гидрогеназы, в возможности получения из одной порции биомассы дополнительного ряда биологически активных соединений, т.е. при получении определенного количества гидрогеназы, убихинона и менахинона происходит экономия сырья реактивов, энергии, рабочего времени. Кроме

Удельная активность, мкмоль Н5 мг белка3,45

Степень очистки51,6 Выход фермента, %6,6

777416

того, отсутствие длительных стадий при очистке гидрогеназы, таких как гель-фильтрация и препаративных- электрофорез в полиакриламидном геле позволяют значительно сократить время получения гидрогеназы.

Формула изобретения

10

Способ получения гидрогеназы с

проведением воздействия на клетки Thiocapsa roseopercisina штамм BBS ультразвука, термообработки, ступен15 чатого фракционирования сульфатом аммония и очистки фермента, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и удельной активности гидрогеназы, расширения

20 технологических возможностей и удешевления процесса, перед воздействием ультразвуком проводят обработку клеток охлажденным ацетоном, ступенчатое фракционирование проводят перед

25 термообработкой, а очистку осуществляют двукратной гидрофобной хроматографией на поперечно-сшитом полимере агарозы с ковалентно присоединенными фенильными группами,способном

30 фракционировать белки с мол.массой 6-1Q4 - 2- 107 дальтон.

28,0

350,0

20,0