Способ выделения и очистки бактериальной НАДН-дегидрогеназы Советский патент 1985 года по МПК C12N9/00 

Од Эд

Изобретение относится к области микробиологии и касается получения НАДН-дегидрогеназы из микроорганизмов .

Известен способ вьщеления и очист ки бактериальной НАЛН-дегидрогеназы, например M.lysodeikticus, путем культивирования штамма-продуцента в питательной среде с последующей дезинтеграцией полученной биомассы, экстракцией и хроматографической очисткой целевого продукта О JОднако известный способ не обеспечивает получение НАДН-дегидрогеназы холерного вибриона.

Целью изобретения является получение НАЛН-дегидрогеназы холерного вибриона.

Эта цель достигается тем, что в способе вьщеления и очисткибактериальной НДЦН-дегидрогеназы путем культивирования штамма-продуцента в питательной среде с последующей дезинтеграцией полученной биомассы, экстракцией и хроматографической очисткой целевого продукта в качестве штамма-продуцента используют холерный вибрион штамм 569 В, дезинтегрирование проводят в смеси с кварцевым песком, полученный дезинтегрант замораживают при минус 18-20°С в течение 18-24 ч, оттаивают при комнатной температуре, центрифугируют при 8000-10000 J на холоду, надосадочную жидкость пропускают через колонку с сефадексом G-200 при температуре 4-6 С и элюируют целевой продукт 0,01 М K/Na фосфатным буфером рН 7,7-7,9.

Пример. В качестве продуцента используют холерный вибрион классического биовара, серовара Инаба штамма 569 В, который хранится в коллекции музея живых культур института Микроб. Культуру штамма-проду цента выращивают при 34-36 С в течение 10 ч в 250 л реакторе-ферментере в условиях аэрации глубинным методом на бульоне из ферментативного гидролизата казеина рН 8,0, содержащего 200 мг % аминного азота, 2% пептона, 0,5% NaCl, 0,05% . Бульоную реакторную культуру холерного вибриона инактивируют 0,6% формалина время экспозиции 16-18 ч. Отделение бактериальньи клеток проводят проточным центрифугированием при 10000-12000 j . Биомассу подвергают

механической дезинтеграции путем растирания ее в смеси с кварцевым песком в течение 30 мин (на одну часть биомассы берется семь частей кварцевого песка). Дезинтегрированные клетки холерного вибриона отделяют от кварцевого песка декантацией. Разливают небольшими порциями в колбы объемом по 0,5-1,0 л на 18-24 ч помещают в низкотемпературный рефрижератор при минус 18-20.С для замораживания. Затем замороженный дезинтеграт вынимают из рефрижератора и оставляют при комнатной температуре на 5-6 ч. При. оттаивании образуется нерастворимый гелеобразный осадок (флокулят) и жидкая фракция. Нерастворимый осадок отделяют центрифугированием при 8000-10000 в течение 30740 мин при 1-2°С. Полученную при этом прозрачную опалесцирующую надосдочную жидкость (уже частично освобожденную от белково-нуклео-полисахаридных компонентов) очищают с помощью гельхроматографии. Хроматографическую колонку размером 50-2,0 см, имеющую систему охлаждения, наполняют сефадексом 6-200. На гель сефадекса наносят надосадочную жидкость, содержащую НАДН-дегидрогеназу В качестве элюирующей жидкости используют 0,01 М K/Na-фосфатный буфер рН 7,7-7,9. Элюцию фермента проводят со скоростью 21 мл/ч. Фракции объемо 5/6 мл собирают на -автоматическом коллекторе. Каждую фракцию испытывают на содержание белка (по поглощению длины волны 280 нм и более точн по методу Лоури) и на активность НАДН-дегидрогеназы.

Все операции по выделению НАДН-дегидрогеназы проводят на холоду при 4-6°С -и под контролем определения удельной активности фермента. Активность НАДН-дегидрогеназы определяют спектрофотометрически по скорости восстановления 2,6-дихлорфенолиндофенола (2,6-ДФИ) в инкубационной смеси,состоящей из 0,0001 2 М НАДН-Ыаг, 0,00012 М 2,6-ДФИ и 0,5 М трис-НС1 буферарН7,6.0 скорости восстановления

2,6-ДФИ судят по снижению оптической плотности инкубационной смеси после добавления ферментного препарата через 30 с в течение 3 мин. Оптическую плотность определяют при длине волны 600 нм. Активность НАДИде.гидрогеназы выражают в условных единицах. За условную единицу принимают то количество фермента, которое способно понизить оптическую плотность инкубационной смеси на 0,01 цены деления шкалы спектрофотометра СФ-26 за 1 мин. Путем отно шения НДДН-дегидрогеназной активВеличина удельной активности НАДН-дегидрогеназы холерного вибриона на различных этапах вьщеления и очистки

11364794

ности ферментного препарата к концентрации белка в нем рассчитывают удельную активность фермента.

5 Результаты определения удельной НАДН-дегидрогеназной активности на всех этапах вьщеления фермента представлены в таблице.

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ НАДН-ДЕПЩРОГЕНАЗЫ путем культивирования штамма-продуцента в питательной среде с последующей дезинтеграцией полученной биомассы, экстракцией и хроматографической очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью получения НАДН-дегидрогеназы холерного вибриона, в качестве штамма-продуцента используют холерный вибрион штамм 569В , дезинтегрирование проводят в смеси с кварцевым песком, полученный дезинтегрант замораживают при минус 18-20 С в течение 18-24 ч, оттаивают при. комнатной температуре, центрифугируют при 8000-10000 на холоду, надосадочную жидкость пропускают через колонку с сеАадексом G-200 при температуре и элюируют целевой продукт 0,01 М K/Na фосфатным буфером рН 7,7-7,9.

Исходный препарат

(дезинтегрант

биомассы Vibrio

cholerae 569 B)

Первый этап вьщеления (ьамораживание и оттаивание

дезинтегранта)

Второй этап вьщеления (хроматография

на сефадексе . (,-200

Из 100 г биомассы вибриона классического биовара, серовара Инаба штамма 569 В получают 1,12 г ферментного белка.

НАДН-дегидрогеназа обладает антигенными и иммуногенными свойствами.

10 ±2,170,32 10,05

2f,0t1,672,35±0,2 7,3

0,,001

12,311,745,7tO,4 17,8

0,,001

что позволит использовать данный препарат для конструирования вакцины.

Использование способа позволяет простым методом получить ферментный препарат НАДН-дегидрогеназу холерного вибриона высокой степени очистки.