Способ получения пептидов Советский патент 1974 года по МПК C07C103/52 

Один из самы.х удобиы.х способов получения пептидов состоит в связывании Ы-ациламивокислоты или N-ацнлпептида с эфиром аминокислоты или эфиром иентида посредством дициклогексилкарбодиимнда (ДСС). При связывании пептидов пронсходпт значительная рацемизация и образование -ацилмочевин, которые загрязняют продукт синтеза и снижают выход. Добавки от 1,1 до 2 эквивалентов N-оксисукцинимида для синтеза пептида с дициклогексилкарбодиммндом снижают рацемизацию и препятствуют образоваиию N-ацилмочевнвы. Однако N-окснсукцинимид реагирует с дициклогекснлкарбодиимидом и нельзя получить пространственно затрудвевные сложные эфиры М-ацнлпептпд-М-оксисукцинимида. Соединение из 1 моль дициклогекснлкарбодиимнда и 3 моль N-оксисукцнинмида было названо позднее сложным эфиром сукцииимидооксикарбонил-р-аланинокснсукцнннмнда. Это соедивевие легко реагирует с амивами, давая производные мочевины р-аланинамидов. При реакции а-бевзилового эфира ВОС-а-глутам иновой кислоты с М-оксисукциви-мндом и дициклогексилкарбодиимидом и последующей добавке 2, 4, 6-триметоксибензиламина выделялся в значительном количестве сукцинимидооксикарбонил-р-аланин-2, 4, 6-триметоксибензиламид. При использовави-и дициклогексилкарбодиимида (ДСС) добавка 1-оксибевзтриазолов (ОБТ) также снижает рацемизацию и препятствует образованию N-ацнлмочевин (см. табл. 1 в примере 1, А). Кроме того, ве могут образоваться побочные продукты, возможные при добавке N-оксисукцивимида. 1-Оксибензтриазолы значительно превосходят известную добавку N-оксисукцинимида при синтезе пептида с ДСС. Таким образом, иредложен способ получения пептидов, который заключается в том, что защищенную аминокислоту или защищенный пептид, у которых карбоксильная группа, которая должва вступать в реакцию, свободна, подвергают реакции с защищенным эфиром аминокислоты или эфиром пептида или амидом пептида, у которых аминогруппа, которая должва вступать в реакцию, свободна, в обычном в химии пептидов растворителе в присутствии карбодиим.ида прИ добавке 1-2 эквивалентов 1-оксибевзтриазола общей формулы I

-N

Ч

N

/

N I Oil

в которой R обозначает водород, галоге г, трифторметил-, нитро-, группу амида сульфокислоты, карбоксампд-, циаио-, низшую алкил и/нлн Л1етоксл-пл1л этокснгрупну и п обозначает числа 1-4.

Из N-защищенных аминокислот и пептидов при помощи 1-окспбензтриазолов и дициклогекснлкарбоднимида могут нолучаться активированные продукты, которые используются для синтеза пептпдов. Прн этом образуются «активированные сложные эфиры, которые в растворе, очевидно, находятся в равновесии с «активированным амидом. В зависимости от вещества может выделяться активированный сложный эфир или активированный амид. Как правило, нет однако необходнмости в выделении активированного нродукта.

Эти новые актнвированные соедннения исключительно быстро реагируют с первичными и вторичными аминами. При синтезе Z-PheVal-ОСНз нз Z-Phe-OBT и H-Val-ОСНз-HCl при добавке 1 эквивалента N-этилморфолина уже через 5 мин при 0°С образуется более 90% пептида. При использовании эфира N-оксисукцинимпда лишь через 2 ч при 0°С достигается 90%-ная ступень. Другим преимуществом является то, что сложные эфнры не требуется выделять, так как 1-оксибензтриазол и его производные, в протнвоположиость N-окснсукцпнимпду, не образуют с дициклогексилкарбодиимидом побочных иродуктов. Это легко обнаруживается, например, хроматографией на бумаге.

С дициклогексилкарбодиимидом и 1-оксибеизтриазолом тридекаиеитид оставался без изменения через 15 ч.

При активации -защ11щенных неитидов, которые не имеют в качестве аминокислоты с концевой карбоксильной пролина и глицина, происходят небольшая рацемизация. Однако и эфиры Ы-оксисукцпнимнда с дицнклогексилкарбодиимидом не могут иолучаться полностью без рацемизации (см. табл. 2, пример 1, Б). Кроме самого 1-оксибензтриазола могут применяться следующие ироизводные; 6-хлор-1-окси-5-изопропилбензт риазол или 5-хлор-1-окс1 -7- метил- 6-иитробензтриазол, а также упомянутые в примерах соед1игения.

В качестве карбоднимидов могут применяться обычные в химии пептидов соединения. В качестве защитных групп для тех функциональных групп аминокислот и иептидов, которые должны быть защищены, исиользуют все обычные в химии пептпдов защитные группы. Полимерные смолы, например оксиметилиолистпрол, также могут иримепяться как защитные группы.

Для иолучения примененных согласно изобретению и еще не описанных в литературе замещенных в ядро 1-оксибензтриазолов соответствующие о-хлорнитробензолы нагревают известным образом в спирте с 3 эквивалентами гидразингидрата или с 1 эквивалентом гидразингидрата и 2 эквивалентами триэтиламина. Образующуюся соль гидразина или триэтиламина замещенного в ядро 1-оксибензтриазола растворяют в воде и подкисляют, причем замещенные в ядро 1-оксибеизтриазолы осаждаются.

Соответствующими, обычными в химии пептидов растворителями являются, например, диметилформамид, диметилацетамид, тетрагидрофуран, диоксан, пиридин, сульфоокись диметила или хлористый метилен. Температура реакции обычно от -20 до +40°С, преимущественно около 0°С.

Из защищенных карбоксилом трудно растворимых в воде иептидов добавленный 1-оксибензтриазол может полностью извлекаться ири встряхивании с раствором бикарбоната или калия или содовым раствором. Подкпслеипем этих промывных растворов бикарбоната натрия снова осаждать использованный 1-оксибензтрпазол. Это невозможно, например, при добавке N-оксисукцинимида, растворяющегося также в кислотах. Из труднорастворимых пептидов можно посредством изоиропанола, спирта, метанола, тетрагидрофурана или горячей воды извлечь 1 -оксибеизтриазол.

В1)1ход во всех исследованных примерах с добавкой 1-оксибензтриазолов был выше, чем с добавкой или без добавки N-оксисукцииимида.

Как видно из данных табл. 1, рацемизация ири использовании дициклогексилкарбодиимида в тетрагидрофуране в качестве растворителя становится ниже 1%, если добавляют 2 эквивалента 1-оксибензтриазола. Если в качестве растворителя применяют диметилформамид, то при добавке 2 эквивалентов незамещенного 1-оксибеизтриазола появляется небольшая рецемизация, в то время как при добавке I -1,2 эквивалентов рацемизация остается ииже 1%. При добавке N-оксисукцинцмида получается как раз наоборот. Если пептид активируется ири иомощи дициклогексилкарбодиимида и 1-оксибензтриазола, то п здесь самая минимальная рацемизация достигается с 1 эквивалентом 1-оксибеизтриазола. В тетрагидрофуране оиа даже остается ииже 1%. При добавке Ы-оксисукцинимида и здесь получается иаоборот (см. табл. 2).

Предлагаемый способ имеет большое зиаченне для получения сериниеитидов, так как применяемый в большинстве случаев метод с азидом дает меньшие выходы. Из N-карбобензоксисериназида образуется также через изоаианат в качестве иобочного продукта 4-карбобе113окс11а-миноксазол11дннон-2. При одном применении д 1циклогексилкарбодиимида образуется в качестве побочного продукта Nацнлмочевнна.

Если получают глутампнил- или аспарагынилпептиды посредством дициклогекснлкарбодипмпда, то в результате дегидратации группы ампда кпслоты образуются в значительном количестве соответствующие нитрилы. При N-аинласпарагине возможно также образование вм.ида. Так, аспарапшилпептиды могут получаться только с выходами 39-45%. добавке 1-оксибензтриазола в случае использования дициклогексилкарбодиимнда можно, однако, с хорошими выходами, быстро и в чистом виде получать глутампнил- и асиарагинплпептид.

Аргпнпниеитиды с протоинрованной гуанидогруипой также можно получать предлагаемым сиособом в чистой форме и с лучшпм выходом. Возможио даже иолученпе активироваииого сложного эфира из протонпрованного Ы-ацпларгиппна и 1-оксибензтрназола, который иревращается дальше без выделения.

Как структурные -элементы иолучеяных предлагаемым способом пептидов принимаются в расчет все а.минокислоты в их Z или D-форме, которые можно встретить в суш,ествуюн;их в природе иептндах. Возможно также применение -аминокислот, наиример р-аланина или других аминокнслот, которые могут получаться только сннтетнческпм или полусиитетическим путем, например а-метилаланина, а-метпл-3,4-диокси-а-фенилаланнна или р-хлораланина.

Продукты нредлагаемого способа иосле отщеилеиия заш,птн111х групп можно применять как тераиевтическпе средства или использовать как иромежуточные продукты для изготовления других ценных в терапии пептидов, например окситоцпна, вазонресс1И1а, глюкагона, АКТГ (адрепокортикотроиного гормона), секретина, тиреокальцитонпна млн инсулина.

В оиисанпи амирюкнслоты сокрао.1.аются по действуюш,им международным правилам. Кроме того, ирименяются следующне сокраи1ения:

AsN - аснарагнн

GIN - глутам1И1 Z - карбобензокспВОС - грег-бутнлокснкарбоннл

NPS - о-иптрофенилсульфенил

ОСНз- сложный метиловый эфнр

OBut - г;;ег-бутиловый эфнр

DAIF - диметнлформамид

DCC - дициклогексилкарбодпимид

ТПР - тетрарндрофуран

ONB - «-пнтробензиловый эфнр

ОВТ- 1-окси-1,2,3-бензтрназнловый эфир.

Все названные ннже аминокислоты применяют в L-форме.

Пример I. Опыт но рацемизации с ирименепнем газовой хроматографии

Вместо Z-LcH-Phe-OM ирнменялся ВОС-Leu-Phe-OH, образуюн.1ийся полностью защищенный пептдгд BOC-Leii-LDPlie-Val-OBnt

МОГ гндролизоваться без нредыдущего отш,еиления защитной группы.

А. Испытание на рацемизацию прп псиользованни дициклогексилкарбодиимида с различными добавками.

378,5 мг BOC-Len-Phe-OH (1 моль и 209,7 мг H-Val-OBut-HCl (1 ммоль) растворяют в 2 мл абсолютного DMF или тетрагидрофурана. Добавляют 0,12 мл N-этилморфолина (1 ммоль) и охлал дают в ледяной бане. После этого вводят добавкн и в заключенне охлажденный до 0°С раствор 207 мг DCC (1 ммоль) в 1 мл абсолютного днметилформамида или тетрагидрофурана. Выдерживают исходные смеси 5 ч при 0° н около 15 ч прн комнатной температуре, разбавляют приблизительно 30 мл уксусного эфира, фильтруют выпавший осадок, экстраг 1руют фильтрат встряхиванием с иасыщенным раствором бикарбоната натрия, 2 н. лимонной кислотой, насыЕценным раствором бнкарбоната натрия н воды, сушат нри иомощи сульфата иатрия, сгущают н ироизводят хроматографию остатка в уксусном эфире на 3 г основной окисп алюминия (активная ступень I). Элюат (около 40 .ил) сгущается и остаток растворяется нриблизнтельно в 5 мл 8-9 н. раствора соляной кнслоты в метаноле и нагревается в тугоилавкой трубке 24 ч до 70°С. Раствор соляной кислоты в метаноле сгун ается и обрабатывается известиым сиособом.

В табл. 1 ириведены результаты.

Таблица 1 Исследования рацемизации при использовании

дициклогексилкарбодиимида и различных добавок

50

00

60

65 Б. Испытание на рацемизацию при активировании пептидов дициклогексилкарбодиимидом и 1-окси-1,2,3-бензтриазолом или N-оксисукцинимидом. 378,5 мг BOC-Leu-Phe-OH (1 ммоль и добавку растворяют в 2 мл абсолютного DMF или тетрагидрофурана. Охлаждают до 0°, добавляют охлажденный до 0° раствор 207 мг DCC (1 ммоль) в 1 мл абсолютного DMF или тетрагидрофурана и выдерживают 2 ч при 0°. Затем добавляют 209,7 мг H-Val-OBut-HCl (1 ммоль и 0,12 мл этилморфолина (1 ммоль), выдерживают еще 3 ч ири 0° и оставляют около 15 ч при комнатной температуре. Затем производят обработку, как в примере I, А. Результаты приведены в табл. 2. Таблица 2 Исследования рацемизации при активировании пептидов дициклогексилкарбодиимидом и 1-оксибензтриазолом или N-оксисукцинимидом В. Полученпе BOC-Zeu-Phe-OIi. 38 г фенплаланина .растворяют в 345 мл диоксана и 115 мл 2 н. натрового щелока. Добавляют 38 г BOC-LeuOSu и перемешивают около 20 ч при комнатной температуре. Осадок (избыток фепилаланина) отсасывают и фильтрат сгущают. Остаток распределяют между 200 мл уксусного эфира и 220 мл 2 н. лимонной кислоты. Фазу уксусного эфира еще раз экстрагируют, встряхивая с 2 н. лимонной кислотой и водой, сушат сульфатом натрия и сгущают. Остаток растирают с петролейным эфиром. Выход 39,3 г, точка текучести 108- 111°С, перекристаллизация пз смеси уксусного эфира и иетролейного эфира; выход 33,3 г, точка текучести 112-115°С, ,5° (, метанол). Г. Получение H-Val-OBut-HCl. N-Карбобензокси- L- валин-трег-бутиловый эфир подвергают каталитическому гидрированию в метаноле посредством Pd-каталпзатора прп помощи самотптратора при рП 5 (добавка 1 и. раствора ИС1 в метаноле). H-Val-OBut-HCl может иерекристаллизовываться из уксусного эфира. Точка текучести 148°С, + 19,22°С (с 2, метапол). П р и м е р 2. Сиитез Z-Val-Val-ОСНз ири использовании дициклогексилкарбодпимида с различными добавками. А. Однооиерацпоииый метод (общая инструкция) 2,5 г Z-Val-OH (10 ммоль), 1,7 г li-Val-OMe, НС1 (Q ммоль), 1,28 мл N-этилморфолииа (10 ммоль) и 10-20 ммоль замещенного 1-о;ксибензтр1иазола формулы I охлаждают до 0°С в 20 мл абсолютного тетрагидрофурана прИ перемешивании. Добавляют охлажденный до 0°С раствор 2,2 г DCC в абсолютном тет|рагидрофуране и оставляют при иеремещи1вании 1 ч при 0°С и 1 ч при комнатной температуре. Осадок отсасывают, фильтрат сгущают И остаток растворяют в этилацетате. Раствор промывают насыщенны.м раствором бикарбоната натрия, 2 н. соляной кислотой, насыщенным раствором бикарбоната натрия и водой, сушат сульфатом иатрия, сгущают и остаток растирают с петролейиым эфиром. Результаты, полученные со сложны.м эфиром дипептегда при .исаользавашю различпых 1-оксибензтриазилоь в качестве добавки, лриведены в табл. 3. Б. Предварительное активирование карбоксильной компоненты (общая инструкция) 2,5 г Z-Val ОН (10 ммоль) и 10-20 лшол/ замещенного Ьоксибеизтриазола формулы I вводят в 10 мл а бсолютного тетрагидрофурана и разбавляют при 0°С холодным раствором 2,2 г DCC в абсолютном тетрагидрофуране. Выдерживают 1 ч при 0°С и 1 ч ири комнатной температуре, добавляют 1,7 г H-Val-ОМе-НС1 (10 ммоль) и 1,28 мл н-этилморфолина (10 ммоль) и оставляют при иеремрщивании 1 ч при компатной температуре. Обработка, как в примере 2, А. Результаты, полученные со сложным эфиром дипептида ирп пспользовании различных 1-оксибензтриазолов в качестве добавки, прпведены в табл. 3. Т а б л п ц а 3 Получение Z-Val-Val-OMe 1 -Окси-6-бензтриазолсульфокислый диэтиламин 1-Окси-6-бензтриазолсульфокислый метиламид 1-Окси-6-бензтриазолсульфокнслый амид 1 -Окси-6-трифторметилбензтриазолЬОкси-б-метоксибензтри1 -Окс11-5-метоксибензтр азол1-Окси-5,6-диыетил6ензтриазол1 -Окс11-4-метилбензтриазол1-Окси-5-метилбензтриазол 1-Окси-6-нитробензтриазол 6-Хлор-1-оксибензтриазол 5-Хлор-1-ок ;ибензтриазол 5,7-Д|1хлор-1-оксибензтриазол6-Бром-1-окс11бензтриазол 4-Хлор-1-окси-7-метил-6-нитробензтрназол6-Хлор-1-окси-5-мстилбенз91,095-99

трмазол 2 1-Окс11-6-мет11л-о-бси,,триG6.0103-105

ачолкарбонитрил 1 1-Оксибензтрназол

82,492-103 2

93.499-102

1

90,7103-107

П р 1 м е р 3. Синтез асиарагпиил- и глутамииил пептидов.

А. Z-AsN-Leu-ОСНз.

К раствору 2,7 г Z-AsN-OM (10 льиолй), 1,7 г H-Leu-OCHg-HCl (10 шоль) и 2,7 г 1-оксибепзтриазола в 20 мл DMF добавляют при 0° 1,28 Л1уг N-этилморфолииа (10 ммоль) и в заключеипе холодиын раствор 2,1 г DCC в небольшом количестве DMF. Перел ешивают 1 ч при 0° и 1 ч ирп компатной температуре, отсасывают осадок и разбавляют фильтрат водой. Осадок отсасывают, растирают с раствором бикарбоната натрия, снова отсасывают, промывают водой и сушат иа иятпокиси фосфора. Выход 3,35 г (85%), точка текучести 176°, ,3° (с 2, метанол).

Б. Z-GIN-Ala-OBut.

К раствору 2,8 г Z-GIN-OH (10 .и.иоль), 1,8 г H-Ala-OBut-HCl (10 ммоль) ц 1,35 г 1-оксп1,2,3-бензтриазола (10 ммоль) в DMF добавляют прп 0° 1,28 мл N-этилморфолина (10 ммоль) и в заключение холодный раствор 2,1 г DCC в небольшом количестве DMF. Поступают затем, как в примере 3, А. Выход 3,0 г (73,7%), точка текучести 158-161°, ,0 (с 2, в метаноле),

При добавке 2 эквивалентов 1-оксп-1,2,3-беизтриазола выход 2,9 г (71,2%), точка текучести 158-161°.

Пример 4. Z-Ser-GIy-ONB.

К раствору 2,4 г Z-Ser-OH (10 ммоль}, 2,7 г 1-оксибензтриазола (20 ммоль) и 2,9 г H-GIy-ONB-HBr в 30 мл DMF добавляют при 6° 1,3 мл Ы-этилморфол.ииа и в заключение холодный раствор 2,2 г DCC в DMF. Перемешивают 1 ч прИ 0° и 1 ч при комнатной температуре п обрабатывают, как в примере 2, А.

Выход 4,2 г (97,5%). точка илавлеипя 121 - 123°, а)-8,2 (, ледяпая уксусная кислота).

Пример 5. Кортикотроппн-(1-23)-трнкозанеитид-ампд

8,25 г BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-GTu (OBut) -His-Phe-Arg-Tzp-GTy-OH (5,5 ммоль), нзготов.ленного по Ghem. Вег. 96 (1963), стр. 1080, п 12,5 г (5 ммоль) n-Lys(BOG)-Pro-Val-GTy-Lys(BOG)- Lys(BOC)- Arg- Arg- Pro-Val-Lys- (BOC) -Уа1-Туг-ЫН2-тритозилата, который был иолучеи из изготовленного ио Ghem. Вег 97 (1964), стр. 1197 ацетата смешиванием с вычислеииым количеством толуолсульфокислоты в воде, выпариванием растворителя в вакууме и вторичным ocaждeнпe t остатка из смеси пирпдпиа п эфира, растворяют в 150 мл DMF. После добавки 2,7 г 1-окоибензтрИазола (20 ммоль) добавляют прп ко-миаты,ой температуре / раствора 6,5 г (30 ммоль)

DGG в 20 мл DMF. Через 1 ч добавляют вторую треть, через 2 ч последнюю треть раствора DGG. Через 2 ч осаждают сырой продукт реакции при помощи эфира. Выход 19,9 г. Защитные груииы отщепляют известным способом одночасовой обработкой 90%-ной трифторуксуспой кислотой, содержащей немного тиогликолевой кислоты, сырой трикозапептид осаждают эфиром и иро.мывают эфиром. Выход 19,1 г. Для очистки производят хроматографию известным способом на карбоксиметилцеллюлозе.

Пример 6. Z-Leu-Ala-Leu-GIu (OBut) GIy-Pro-Pro-GrN-Lys(BOG)-Arg-OH.

ll,5s (IS ммоль) Z-Leu-Ala-Leu-GIu(OBut)-OH и 2,43 г (18 ммоль) 1-оксибепзтриазола смешивают в 80 см DMF при -10° при перемешивании с 3,7 г (18 ммоль DCC в 25 см DMF. Перемешивают еще 2 ч при комнатной

температуре, отфильтровывают от мочевины и добавляют раствор 13,3 г (15 ммоль) H-GIy-Рго- Pro- GIN- Lys- (BOG)- Arg-,ОН, 1,5 г GHsGOOFI, H2O ,92 см (15 ммоль) N-этилморфолииа в 80 слг DMF. Перемешивают 2 ч

при комнатной темиературе, отгоняют растворитель в вакууме и растирают остаток с уксусным эфиром. Выход сырого продукта 17,1 г. Соединение трижды кииятят с уксусным эфиром, высушенное вещество трижды основательно растирают с водой. Выход 15,5 г

(73,5%); загрязнения имеются лишь в ничтожиых количествах -80,0° (с 2, в

метаиоле).

Вычислено: GIu 2; Pro 2; Gly 1; Ala 1;

Leu 2: Lys 1; Arg 1.

Пайде11о: GIu 2,05; Pro 1,84; Gly 0,98; Ala 1,02; Leu 2; Lys 1,03; Arg 0,92.

NHs: расчетное 1 эквивалент, полученное 1,09 эквивалента.

П р п мер 7. Получение новых замещениых в ядро Ьокспбензтриазо.тов, которые применяются как добавки. Общие ппструкции а) 0,1 моль ароматического о-хлориитросоед П1еиия кииятят с флегмой в 50 мл этанола с 15 г 100%-ного гпдразингидрата (0,3 моль) 5 ч. Охлаждают и отсасывают осадок. Fcлп осадка пет, сгущается маточный раствор. Осадок пли остаток растворяют в воде,

при случае извлекают эфиром и водную фазу подкисляют коицептрированной соляной кислотой, а осадок отсасывают. РезультатЕл приведеиы в табл. 4. б) 0,1 моль ароматического о-хлорнитросоединения нагревают в 50 м.л спирта с 15 г

100%-ного гпдразппгпдрата (0,3 моль) 10 ч

п автоклаве до 10°G. Обработка, как указано

в иуикте а. Результаты ириведеиы в табл. 4.

с) 0,1 моль ароматического о-хлорнитросоединения кииятят с флегмой в 50 мл этанола с 27,2 мл триэтиламииа (0,2 м.оль) и 5 г 100%-йоге гидразиигидрата (0,1 моль) 5 ч. Затем cryniaiOT п остаток обрабатывают, как указано в пункте а.. Результаты приведены

в табл. 4.

и

Новые замещенные в ядро 1-оксибензтриазольг

12

Т а б л и и а 4