Способ получения мембраносвязанных соединений Советский патент 1993 года по МПК C07K13/00 A61K37/02 

Изобретение относится к способу получения мембраносвязанных соединений - новых биологически активных соединений, которые могут найти в биологической медицинской химии.

Цель изобретения - синтез новых производных липопептидов - малотоксичных соединений, обладающих высокой способностью к образованию антител против антигенов и гаптенов и тем самым в получении доступного специфического иммуностимулирующего продукта.

Поставленная цель достигается описываемым способом получения мембрамосвя- эанных соединений общей формулы I:

CeHirCQ-NH-dH-COflH

itftS-Cfy-CH-CfyOCO-CttHM

1 OCOCisHj,

где X: -Ser-Asn(Leu)2-Glu-Cys-Gly-Pro- Arg-Glu-Phe-Val-GJu- Asn-SerOH,-Ser{Lys)4OH

заключающийся в том, что пептидную смолу формулы:

Р-у.

где у - -Ser(But)-Asn(Leu)2Glu(OBu)Cys- GMOBuVPro-Arg-fHVGIu (OBu )-Phe- Val-Glu OB u VAsn-Ser(B ut)

00 Ю CJ 00

VI a

0)

или Settlys(Boc)4

ОВо - сложный бутиловый эфир.

But - бутил,

Вое - третбутилоксикарбонил.

Р - полимерная смола: 0-п-алкоксибен- зил-{сополи)-дивинилбензол-стирол или по- ли-п-бензилоксибензил, полученную путем постепенного наращивания соответствующей присоединенной к соответствующему полимеру пептидной цепи, исходя из С-концевой аминокислоты, с последующим присоединением серина вводят во взаимодействия с

едгсо-кн-сн-сох

CH2$-CHfClKfyO(0-(,sHj, QCOCA SCFjCOOH

и затем полученное соединение обрабатывают анизолом в трифторуксусной кислоте с отщеплением полимера и защитных групп и выделением целевого продукта в виде трифторацетата.

Ниже изобретение поясняется подробнее с помощью примеров, причем вначале расшифровываются примененные в тексте сокращения.

Alt 2-метилаланин, TFE - трифторуксусная кислота, EgFR. фактор роста эпидермиса, Рат - пэльмитоильный остаток DCC дициклогексил-карбомиимид ОМЕ диметилформамид FITC флуоресцеинизотиоцианат Ftnoc флуоренилметоксикарбонил But третичный бутиловый остаток PSDN7B сополимеры стирола и диви- нилбензола со связующими группами 4- (гидроксиметил)фзноксиметила

HoBt 1-гидроксибензотриазол RITC родаминизотиоцианат HulTN(y) антигенная детерминанта интерферона человека 11 - 20

DCU N.N -дициклогексилмочевина ЕЕ этилацетат

Материал и методы экспериментов Химикаты

Растворители высшего качества фирмы Мерк. Высушивание и дистилляцию осуществляли обычными методами. М-метил- морфолин (Мерк) дистиллировали над нингидрином для удаления вторичных аминов. 1-гидроксибензотриазол и дициклогек- силкарбодиимид также производства фирмы Мерк. Все производные L-амино- кислот производства фирмы Бахем. Вос Alb-OH и Aib-OMe.HCI синтезированы по

методам, описанным в литературных источниках.

Тонкослойная хроматография Были использованы готовые пластины из силикагеля 60F254 (фирма Мерк) и следующие текучие средства:

(I)1-бутанол/ледяная уксусная кислота/вода 3:1:1

(II)хлороформ/метанол/ледяная уксус- ная кислота/вода 65:25:3:4

(III)хлороформ/метанол/конц. аммиак/вода 65:35:3:4

(IV)хлороформ/метанол/вода 65:25:4

(V)хлороформ /метанол 1:1

5 в качестве распылительных препаратов использованы: нингидрин, хлор/4,4- бис/диметиламино/дифенилметан/ препарат ТОМ/ и препарат сакагуши. Для сравнения служила дициклогексилмочевина со

0 следующими данными:

Rf (1)0,91, Rf(ll)0,82,Rf(lll)0,92,Rf (IV)0,81, Rf (V) 0.83

Аминокислотные анализы

Для установления идентичности проме5 жуточных ступеней 200-микрограммовые пробы защищенных пептидов гидролизова- ли в 6 N HCI в течение 24 ч при 110°С. Промежуточные ступени и целевое звено сегмента гексапептида, содержащие связь

0 Leu-Leu гидролизовали в тех же условиях в течение 72 часов. Аминокислотные анализы осуществляли в биотронном анализаторе LI 6000 Е с применением стандартных программ.

5 Определение рацемата

Гидролизованные аминокислоты были получены как производные п-пропилового эфира пентафторпропиониламинокислоты и энатиомеры методом газовой хроматогра0 фии отделены в стеклянных капиллярных колоннах с помощью хиразил-вал. Указанные части в процентах D-аминокислот не корректировали на рацемизацию, обусловленную гидролизом.

5 Элементарные анализы

Были осуществлены простые определения С. Н. N на элементарном.анализаторе модели 1104 (Карло Эрба, Милан). Температура плавления

0 Значения температуры плавления были определены по методу Тоттопи и не корректировались

Съемка спектров C-NMR-спектры: 30 мг защищенного

5 эйкозапептида растворили в 400 микролитрах 12С2НС1з/12С2НзО Н (1:1) (фирма Мерк) и измерили в NMR-спектрометре WM 400 (фирма Брукер) в течение 12 ч при 30°С. Круговые дихроичные спектры растворы свободного эйкозапептида (г, 1 1.7мг/мл)

в этаноле, трифторэтаноле, метаноле. 1.1.1.3.3.3-гексафторпропаноле, воде, а также в смеси этанола с водой измерили с помощью дихрографа 11 (фирма Юхан-Руссел).

Хроматографическая очистка

Защищенные промежуточные ступени пептида до окончания реакции сочетания и удалении растворителя в масляном вакууме растворили путем добавки одинакового объема СНОз/МеОН 1:1, отцентрифугировали от дициклогексилмочевины и хроматогра- фировали на сефадексе Ш 20: колонна 3 х 115 см; растворитель СНС з/МеОН 1:1; количество 35 мл; скорость течение 8.40 мл/10 мин. Фракции по 3 мл исследовали в сис те- ме 11 методом тонкослойной хроматографии (препарат ТОМ). Пептиды появились в объеме растворителя 165-190 мл. Фракции объединили, удалили растворитель в вакууме, остаток высушили над P20s. Аминокис- лотный анализ дал ожидаемые значения и содержание пептида 92-96%

Пример 1 Получение PamsCys-EgF- R (516-529)

После обычного ступенчатого синтеза (синтез Меррифилда) под защитой N- Р.тос/(Ви ).Оос/Н08т и симметричных ангидридов) сегмента EgF-R (526-529) получили последней аминокислоту Ртос-5ег(Ви )-ОН. После отщепления защитной группы смесью пиперидин: DMF (1:1, 15 мин) связанный со смолой пентадекапептид EgF-RH.SertBur- Asn-Leu-Leu-GluODBuVCys-Glu-Pro-ArgtH ) -Glu(OBuVPhe-Val-Gtu(OBul -Asn-Ser(BuV

0-р-алкокри-бензил-сополи(дивинил- бензол-стирол) (1 г, загрузка 0,5 ммоль/г) был соединен с РатзСузОН(РатО) (СН2СН (PamO)SCH2CHNH(OPam) (2 ммоль

СО-ОН

в DMF/CH2CI2 (1:1)) и DCI/HOBt (2 ммоля, при 0°С, с предварительной активацией в течение 20 мин (16 ч), затем дополнительное соединение (4 ч). Липогексадекапептид был отщеплен трифторуксусной кислотой (5 мл) с добавлением тиоанизола (0,25 мл) в течение 2 ч.

Выход:

960 мг (76%) PamaCys-Ser-Asn-Leu- Leu-Glu-Gly-Glu-Pro-Arg-Glu-Phe- Val- Glu-Asn-Ser-OH x CF3COOH

аминокислотный анализ

2,00 (2), 1,97 (2). 4.29 (4). 0,88 (1).

1,05(1), 1.13(1). 1 12(1). 0,98(1).

1,02(1)

Температура разложения 173°С.

Индекс Rf: система Н-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (2-V1) 0.62.

Молярный вес 2 61621 (в виде трифто- рацетата)

БрутТО-фОрМула C124H212N20034SF3

Пример 2. 1. Получение РатзСуз- Ser(Lys)40H

Pam3CysSer(Lys)4-OH был синтезирован по методу твердой фазы(МЕРРИФИЛД) на сополимере р-алкоксибензилспирт-PS- DNB (1%)с N-Fmoc-аминокислотами и кис- лотонеустойчивой защите боковой цепи (t-Bu для серина и Вое для лизина). Применены симметричные ангидриды Fmoc-аминокис- лот. Сцепление на PamaCysOH было осуществлено по методу DCC/HOBt и повторено для достижения лучшего количественного превращения. Для отщепления липопепти- да от смолы-носителя и для удаления защиты боковой цепи смолу два раза в течение 1,5 ч обрабатывали трифторуксусной кислотой, которая в заключение была удалена в ротационном выпарном аппарате в высоком вакууме. Продукт был перекристаллизовак из ацетона.

Элементарный анализ, как и 13С-спектр указывает на то, что липопептид представлен в виде трифторацетата. Принимая, что Pam3CysSer(Lys)4-OH представлен в виде амфотерного иона, остаются еще три Ј -аминогруппы, которые могут быть протонизиро- ваны от трех молекул трифторуксусной кислоты.

13C-NMR-cneKTp PamsCys Ser-{Lys iOH 3TFE показывает, что соединение представлено в виде трифторацетата (квартет СРз-групп при 110-120 частях на миллион, а также карбонильные сигналы при 161-162 частях на миллион). Вследствие агрегации полярной части молекулы линии Lys и Ser-C-атомов значительно расширяются. Карбонильный сигнал при 206.9 частях на миллион происходит от остающегося ацетона, примененного для перекристаллизации. Молекулярный вес:

1510,4

Элементарный анализ.

,

С 56,40 С 55,58

Н8.70 Н 9.33

N7,56 N6,54

S 1,73 52,61

Аминокислотный анализ:

Аминокислотный анализ выявил соотношение серина к лизину 1:4,2. Образующиеся при гидролизе характерные продукты разложения (6 N HCI, 110°С. 18 ч) S-глице- рил-цистеина были в наличии (сравнение с известными стандартами). Доля пептидов рассчитана на 83%. 3 молекулы TFE на липопептид соответствуют доле пептида 80.2%, хорошо соответствуя анализу

II. Получение РатзСуз-5ёг-()4-ОН хЗТРЕ

II. 1. Сцепление Fmoc-Lys(Boc)OH на смоле-носителе Fmoc-Lys(Boc)-OH (4,5 г, 9,6 ммолей) примешивают в 15-20 мл DMF (СН2С1 1:1) v/v (при 0°С с DCC (0,99 г. 4,8 ммолей). Через 30 мин отфильтровывают от осажденной мочевины в утку для встряхивания, в которой помещены р-бёнзилокси- бензил-спирт-смола (2,5 г, 1,6 ммолей ОН-групп). После добавки пиридина (0,39 мл, 4,8 ммолей) встряхивают в течение 18 ч при комнатной температуре. Растворитель отсасывают и смолу 3 раза промывают каждый раз 20 мл DMF/CH2CI2 и DMF. Смолу сначала смешивают в 20 мл CH2CI2 с пиридином (28,8 ммолей, 6Ад) и затем с бензоил- хлоридом (28,8 ммолей, 6 Ад). Встряхивают в течение 1 ч при комнатной температуре. Растворитель отсасывают и смолу промывают 3 раза 20 мл CHzCI, DMF, изопропано- лом и РЕ-30/50.

II. 2. Симметричный ангидрид Fmoc-ами- нокислоты Fmoc-Lys(Boc)-OH (4,5 г, 9,6 ммо- ля, 3 Ад) растворяют в 15 мл CH2CI2/DMF и смешивают при 0°С с DCC (4,8 ммолей, 1,5 Ад). Через 30 мин при 0°С отфильтровывают от мочевины непосредственно в реактор и обрабатывают дальше, как указано в нижеследующей таблице.

Следующее положение пригодно для 1 /5 примененного в начале количества смолы (0,5 г, 0,32 ммоля ОН-групп).

Fmoc-0- бутил-серин (0,74 г, 1,92 ммолей) растворяют в 4 мл CHsCte/DMF и смешивают с DCC (0,96 ммоля) при 0°С.

Через 30 мин при 0°С отфильтровывают от мочевины непосредственно в реактор и, как обычно перерабатывают.

II. 3. Присоединение к PamsCys-OH

РатзСуз-ОН (0,58 г, 0,64 ммоля) растворяют в 5 мл CHzCl2(DMF 1:1) и при 0°С смешивают с HOBt (93 мг, 0,64 ммоля) и DCC(0,64 ммоля). Через 30 мин при 0°С смесь загружают непосредственно в реактор. Через 16с встряхивания осуществляют дополнительное сцепление с вышеуказанным молярным отношением в течение 4 ч. Растворитель отсасывают и смолу промывают три раза 20 мл DMF/CH2Cl2H DMF.

II. 4. Отщепление гексапептида от полимера

Вое - защищенное соединение пептида и полимерной смолы (около 1 г) из И. 3 хорошо промывают СН2С12 и 2 раза в течение 1,5 ч встряхивают со смесью из 5 мл TFE и 0.5 мл анизола. Фильтрат концентрируют в вакууме, а остаток помещают в 5 мл СНСЬ. Pam3Cys-Ser(Lys)dOH x 3TFE кристаллизовывается после добавки 50 мл ацетона при - 20°С, центрифугируется и сушится в высоком вакууме.

Выход: 0.41 г (85%)

Температура плавления:

205°С(разл.)

Тонкослойная хроматография на пластинах силикагеля: Rf 0.42

(Растворитель: n-ВиОН /пиридин Н20/ ледяная уксусная кислота 4:1:1:2)

Rf 0,82

(растворитель: nBuOH /МеОН/Н20/ле- дяная уксусная кислота 10:4:10:6)

Аминокислотный анализ:

Ser 0,95 (1); Lys 4 (4)

Молекулярный вес:

C87Hi59NioOi9SF9 (1852,6) Элементарный анализ:

Расч. С 56,40 Н 8,70 N7,56 S 1.73

Осажд. С 55,58 Н 9.33 N 6,94 S 2,61

III. Получение Parrt3Cys-Ser-(Lys)4-OH- FllCx2TFE

Флюоресциинизотиоцианат (3,9 мг, 10 микромолей) растворяют в 2 мл хлороформа и добавляют в раствор Pam3Cys-Ser-(Lys)4- ОН x 3TFE (18,5 кг, 10 микромолей) в 2 мл хлороформа. После добавки 4-метилморфо- лина (10 микролитров, 10 микромолей) перемешивают в течение 1 ч и затем растворитель удаляют в ротационном выпарном аппарате. Остаток растворяют в 10 мл хлороформа и ацетона 1:1. Желтый продукт выпадает в осадок при - 20°С, его центрифугируют и сушат в высоком вакууме.

Выход:

16 мг после очищения сефадекс LH20 Продукт представлен в виде трифтора- цетата и очень сильно флуоресцирует при возбуждении ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 366 нм-. По сравнению с исходным продуктом f-аминогруппа ковалент- но связана с FITC. Из этого следует суммарная формула Pam3Cys-Ser-(Lys)4- OH-FITC х 2 TFE с условием, что амфионная структура сохраняется.

Молекулярный вес: Cio6Hi69Nn022S2F6 (2127.68)

Тонкослойная хроматография на пластинах силикагеля:

Rf 0.72

(растворитель: n-бутанол/пиридин/во- да/ледяная уксусная кислота 4:1.1:2)

Rf-0.73

(растворитель: n-бутанол/муравьиная кислота/вода 7:4:2)

Аминокислотный анализ:

Ser 1,11 (1.00): Lys 4 00 (4 00)

Имеются продукты гидролиза глицерил- цистеина

IV. Получение Pam3Cys-Ser-(Lys)4-OH x ЗНС

Pam3Cys-Ser(Lys)40H x 3TFE 185.2 мг (0,1 ммолей) растворяют непосредственно в небольшом количестве хлороформа и добавляют приблизительно такое же количество эфирного раствора HCI. Хорошо встряхивают, причем часть выпадает в оса- док, но большая часть остается в растворе. Вращают в ротационном выпарном аппарате до получения сухого продукта и снова добавляют эфирный раствор HCI. После многократного повторения этой операции растворяют остаток в небольшом количестве хлороформа и добавляют ацетон до помутнения раствора. Продукт кристаллизуют в бесцветный порошок при - 20°С, отсасывают и сушат в высоком вакууме.

Выход:

153 мг

Молекулярный вес:

CeiHisgNioOnSCb (1619,63)

Элементарный анализ

Расч. С 60.07 Н 9,89 N 8,65

Осажд. 057,64 Н 11,20 N8,39

В продукте остается излишняя HCI.

Масс-спектромегрия с десорбцией поля:

-пик появляется при т/е 1510, а также М+ 1 и М+ -(- 2. Характерны протониро- ванные фрагменты PamaCys-OH (908,5) при т/е 910, 909,911 и 912.

Опыты по иммунизации

Осуществлена ковалентная связь Е-кле- точного митогена, который является одновременно отличным носителем и сильно действующим катализатором, с синтетическими антигенными детерминантами. С этой целью был применен синтетический ли- попептид 5-{2,3-бис(пальмитоилокси)пропил)- М-пальмитоил-цистеинилсерин(РатзСу$-8ег), представляющий собой N-терминал липоп- ротеина из внешней мембраны эшеришиа ко- ли. Особенно выраженные в ковалентной связи с антигеном амфифильные свойства обеспечивают, с одной стороны, стабильное сцепление несущего три остатка жирной кислоты соединения S-глицерила в липид- ном слое клеточной мембраны. С другой стороны, в результате этого во внешнем гидрофильном слое мембраны представлен более полярный антиген (или гаптен). Так как активирующее действие липопротеина определяется только его N-терминальной частью, то во всех коньюгатах, несущих PamaCys-Ser или аналогии, сохраняется их иммуностимулирующее действие.

В качестве примера на фиг. 1 приведено применение концепции получения специфических антител против рецептора эпи дермального фактора роста (EGR-R). Для этого путем эпитопного поиска с использованием ЭВМ была выбрана экстрацитоплаз- матическая область 516-529, построена синтезом Меррифилда и затем надстроен Ртос-5ег(Виг)-ОН и затем РатзСуз-ОН. После отщепления смолы аналитическим путем признанный единым коньюгат без других добавок был применен l.p для мышей в одной единственной дозе. С помощью теста EUsa уже через 2 недели были установлены высокие титры специфических антител против тетрадекапептида. Важно, что при контрольных опытах одним очевидно имму- ногенно слабым тетрадекапептидом не получены титры антител,

Так как РатзСуз-конъюгаты сильно им- муногенны и в клеточных культурах, путем иммунизации in vitro можно быстрым и элегантным образом получить условные и мо- ноклональные антитела против слабо иммуногенных соединений.

Преимущества предлагаемого технического решения заключаются в следующем: простота получения химически однозначно определенных коььюгатов антигена-катализатора в любых количествах, в противоположность другим конъюгатам одноразовое применение без многократного компрес- сования, высокая эффективность in vivo и In vitro. Значительное сокращение лабораторных животных, зачастую даже полный отказ от иммунизации In vivo и резкое уменьшение времени, в частности, при ген- технологических работах. Опыты можно проводить также-с системами клеточных культур человека.

Пример иммунизации in vivo.

Balb/C-мыши в возрасте 6-10 недель были иммунизированы путем одноразовой инъекции l.p 50 микрограмм и 500 микрограмм/О,2 мл 10 -10 молярного раствора ковалентно связанного с антигеном катализатора (PamaCys-Ser/EGF-R 515-529). В качестве контроля служили антиген, катализатор и смесь антигена и катализатора в сравнимых молярных количествах, а также средах. Через две недели после инъекции у мышей была взята кровь из ретро- орбитального венозного сплетения для получения сыворотки и определен титр антител опытом ELISA.

Аналогичную иммунизацию можно проводить другим путем, например, внутриве- нозно. орально, ректально, внутримышечно, подкожно.

Было исследовано образование специфических антител без катализатора Фройн- да против тетрадекапептида EGF-R 516-529 по методу иммунизации In vivo, Balb/C-мышей иммунизировали 1 Конъюгатом PamaCys-SerfEGF-R 516- 526):

2.Свободным тетрадекапептйдом, только EGF-R 516-529

3.Только PamsCys-Ser

4.Свободным тетрадекапептйдом (EGF-R 516-529) в смеси с одноразовой инъекцией Ip 0,2 микромолей конъюгата. Титр антител был определен при помощи теста ELISA (орлината при 405 nm).

Через 14дней после иммунизацииу мышей взяли кровь из глазной вены и полученную сыворотку применили в тесте ELISA. Значения получены из среднего значения 3-5 мышей разности между значениями теста ELISA коньюгата PEP 14 BSA и BSA.

Обнаружилось, что только при использовании мембраносвязанного биологически активного конъюгата согласно изобретению найдены значительно повышенные, многократно превышающие в активности предшествующие способы концентрации антител.

Пример иммунизации in vitro.

Клетки селезенки мыше тьтисироес ли в течение 5 дней в присутствии коныогата ParmCvs-S«3(EGF 515 529) катализатора PamiCys-Ser, тешадекапептидэ EGF-R 16-529 смеси антигена и катализатора и питательной среды.

Лимфоциты были культивированы при плотности клотпк 2:5 х 10 /мл R течение 48 ч в 0,2 мл делимого количества, в питательной среде RPMI 1640, накопленной с 10% термоактивирооанного глутамином, (2 мМ), пенициллином (1ПО V/мл), стрептомицином (100 мг/мл) и 2-меркаптоэтанолом (5 х 10 5 м),

Надсадочнач жидкость была использована для исследования на специфические антитепа в тесте ELISA

Митогенная активность клеток солезен ки мышей

Митогенная активация Balb/C-клеток селезенки посредством Pam3Cys-Sfir-(Lys)4FITS (окружность), Pam-Cys-Ser(Lys}iOH 3 HCI (треугольники), PamaCys-Serf уз)лОН 3TFE (четырехугольники) видна на чертеже

На чертеже на ординате нанесен индекс стимуляции встраивания 3М-тимидина в DIMA (значения срт включения/значения срт контроля без митогена) против концентрации использооанного биологически активного вещества.

При сравнении опытов, проведенных in vivo и In vitro установлено, что в.опыте in vivo в микротитровых пластинах плоиюсть

клеток: 2,5 х 10б клеток/мл; концентрация вещества: 5 х 10 ммолярная; условия инкубации: 37°С, 5% С02, 5 дней.

Conj.: конъюгат Pa nru Cys-Ser(EGF-R

515-529)

Pep.: тетрадекапептид EGF-R 516-529 Adj.: РатзСуз-Ser

Mix: смесь свободного тетрадекапепти- да EGF-R 516-529 и PamaCys-Ser.

Ив опыте in vitro обнаружено резкое повышение концентрации антител, вследствие чего значительно увеличивается возможность применения клеточных культур, в особенности для получения антител.

Таким образом, описываемый способ позволяет получать мембраносвязанные соединения - малотоксичные и при этом более доступная (благодаря своей синтетической природе), чем известный, выделенный из природных источников прививочный материал.

Формула изобретения Способ получения мембраносвязанных соединений общей формулы I

ЗДгМН-СН-СОХ

CHzS-CHf-CH-CHiOCO-CeHjt ОСОСкНл-ЗСРзСООН

где X - Sei Asn(Leu)2Glu-Cys-Glu-Pro-Arg- Glu -Phe-Val-Glu-Asn- Ser-OH; Ser(Lys)40H, отличающийся тем, что пептидную смочу формулы

Р-у.

где у - Ser(But)Asn-Leu-Leu-Glu(OBu )Cys- Glu(OBu ) Рго-Агд-(Н ) (OBu )Phe-Val- Glu(OBul)Asn-Ser(But) или (Boc)4,

ОВи1 - сложный бутиловый эфир;

But - бутил;

Вое - трет-бутилоксикарбонил,

Р - полимерная смола

о-п-алкоксибенэил-(сополи)-дивинил-бензол-стирол или поли-п-бензилоксибензил, полученную путем постепенного наращивания соответствующей пептидной цепи, исходя из С-концевой аминокислоты, присоединен- ной к соответствующему полимеру с последующим присоединением серина, вводят во взаимодействие с

55 С-йгИНЩ-СН-СООН

сн2$-сн2-сн-снгосо-сцнм осос,5гь,

и затем полученное соединение обрабатывают анизолом в трифторуксусной кислоте с отщеплением полимера и защитных групп и выделением целевого продукта в виде трифторацетата.

Использование: в биологической и медицинской химии, как обладающие специфическим иммуностимулирующим действием. Сущность изобретения: продукт - мембра- иосвяэаиные соединения общей формулы: C«H3iCONH-CKCOXH bSCH2CH(OCOCi5H3i) CH2OCOCt5H3i.CF3COOH. где X - -Ser- Asn.(Leufe. Glu-Cys-Gly-Pro-Arg-Glu-Phe- Val-Olu-Asn-SerOH, . Реагент : пептидная смола Р-у. где у - -Ser{But)-Asn- (Leuh-GMOBuyCys-GlufOBuVPro-Arg (Н) Glu(OBuVPhe-VaHGIu(OBulHVsn-Sei(But) или Serf Lys(Boc)4. OBu - сложный бутиловый эфир. But - бутил, Вое - трет-бутилок- сикарбонил Р - полимерная смола. 0-п-алкоксибензил-(сополи)-дивинил-бен- эол-стирол или поли-п-бензилоксибензил. Реагент II: X - ОН. Полученное соединение обрабатывают анизолом в трифторуксусной кислоте с отщеплением полимера и защитных групп. 1 ил. -г Ј

Последовательное построение пептида с симметричными ангидридами Fmoc аминокислоты

36 ISII 32

28 21 20 16 12 в

t 2

юо юоо

Редактор О. Стенина

0001 001 01 1 Ю

Составитель В. Волкова

Техред М.МоргенталКорректор С. Пекарь

Л CmwwnM

О nM p-Sc-lvO-lKOMi

О

1к«м А Рчт -ЖООч-

LKIUUA

О- fVffft -S«-ll Wt4 rtJ - ОИ

юо юоо