Способ выделения аминокислот из белковых гидролизатов Советский патент 1976 года по МПК C07C99/12 

Изобретение относится к усовершенствованному способу выделения и очистки аминокислот из белковых гидролизатов. Известен снособ выделения аминокислот из различных смесей, содержащих аминокислоты, ионообменной хроматографией. Сорбция и элюирование аминокислот с сорбента длительны, так как для нолного выделения всей суммы аминокислот с хорошим выходом и высокой степенью чистоты необходимо применять несколько типов сорбентов и соответствующих растворителей. С целью упрощения процесса и повышения степени чистоты предлагается выделять аминокислоты из любых белковых гидролизатов в виде их силоксановых соединений. Способ основан на нревращении всей суммы аминокислот, содержащихся в гидролизатах, в смесь соответствующих гексаалкилдисилильных производных общей формулы R-Si-HN-CRR--G-0-Si R где R - низший алкил -метил, этил; R и R - водород или любой другой а-заместитель аминокислот природного происхождения, а также аминокислот, полученных химическим нутем. Получение производных аминокислот такого типа легко и просто осуществляется при взаи.модействии аминокислот с силазанами, доступными промыщленными продуктами, в безводных условиях. Из-за высокого экранирующего влияния триалкилсилильных группировок, связанных с амино- и карбоксильной грунна.ми аминокислот, полученные производные обладают, вероятно, наивысщей летучестью из всех производных аминокислот и хорошей растворимостью в большом числе неполярных растворителей. Благодаря высокой чувствительности к гидролизу в сочетании с указаннылги свойствами дисилильные производные крайне ценны при иснользовании для выделения и очистки аминокислот. На индивидуальных а.минокислотах найдено, что реакции силилнрования и гидролиза полученных производных идут с количественными выходами, с нолным сохранением оптической чистоты взятой для силилирования аминокислоты. Для силилирования можно использовать ряд силазанов, таких как гексаметилдисилазан (СНз)з Si - HN--Si (СНз)з, триметилсилилдиэтиламин (СНз)з - Si - - N-(C2Hs)2, б«с-(триметилсилил) ацетамидсНз-С-0-81-( -(СНз)з Количественное замещение атомов водорода в обеих функциональных группах аминокислот происходит нри использовании триметилсилилдиэтиламина и быс-(триметилсилил)ацетамида, в случае гексаметилдисилазана реакция, в основном, заканчивается носле силилирования одной карбоксильной группы. Исходные силазаны получают с высоким выходом при взаимодействии триалкилхлорсилана с диэтиламином или ацетамидом. В случае триметйлсилилдиэтиламина силнлирование аминокислот идет с выделением диэтиламина, что обеспечивает простой контроль за ходом реакции. Очистка полученных дисилильных производных аминокислот от примесей достаточно просто осуществляется фракционной дистилляцией или экстракцией неполярными растворителями полученной после силилирования реакционной смеси. Превращепие выделенных дисилильных производных в смесь аминокислот легко осуществляется гидролизом водой или спиртом при добавлении их к раствору производных в органических растворителях. Образующиеся в результате гидролиза аминокислоты выпадают и легко отделяются от растворителя, а второй продукт гидролиза - дисилоксан - остается в растворе. Дисилоксан представляет собой целевой продукт в синтезе кремнийоргапических соединений и может быть достаточно просто превращен обратно в исходный силазан. Возможность регенерации исходных силазанов позволяет создать замкнутый цикл использования вспомогательных веществ, что увеличивает экономичность предлагаемого метода выделения и очистки аминокислот из белковых гидролизатов. Предлагаемым способом извлекают все аминокислоты из любых белковых гидролизатов и ферментолизатов практически с количественным выходом. Используя точную фракционную дистилляцию полученных производных, получают конечный продукт с высокой степенью чистоты. Способ выделения и очистки аминокислот заключается в следующем. Сухой гидролизат или ферментолизат белоксодержащих материалов обрабатывают силазаном, например триметилдиэтиламином, при нагревании до 80 - 120° С в течение 1 - 2 час. Температура реакционной смеси устанавливается несколько выше температуры кипения выделяющегося диэтиламина, чтобы при кипении диэтиламина происходило достаточное перемещивание реакциониой массы. По мере заверщения реакции температура смеси постепенно повыщается в указанных пределах и реакция заканчивается с прекращением выделения диэтиламина. При этом часть силазана расходуется на силилирование функциональных групп примесей, содержащих подвижные атомы водорода. Однако различная летучесть и растворимость образующихся производных аминокислот и сопутствующих примесей позволяет выделить аминокислотную фракцию, как показано в приведенных ниже примерах. Пример 1. Суспензию 3 г L-валина в 9,65 г триметйлсилилдиэтиламина нагревали в инертной атмосфере при 120° С (температура бани) в течение 1 час до прекращения отгонки диэтиламина. После стояния в течение ночи реакционную массу фракционировали в инертной атмосфере. Собирали фракцию с т. кип. 91 - 93° С/10 мм рт. ст. Выход 5,41 г (81%). Полученное производное крайне легко гидролизуется в парах влагой воздуха. При гидролизе к 1,15 г дисилильпого производного добавляли 0,08 мл воды в 1,5 мл эфира. После встряхивания выпавщий L-валин огфильтровывали и промывали два раза по 5 мл эфира. Выход 0,49 г (95%). Угол вращения исходного L-валина а равен -|-6,42° ( в воде), угол вращения выделенного после гидролиза L-валина +6,86° (С -0,5 в воде), что указывает на полное отсутствие рацемизации. Пример 2. Суспензию 3,33 г L-аспарагиновой кислоты в 14,2 г триметйлсилилдиэтиламина нагревали в инертной атмосфере в течение 1 час. При 135 - 145° С (температура бани) отгоняли 7,3 мл диэтиламина. Из реакционной смеси фракционной перегонкой в инертной атмосфере выделили 6,24 г силилпроизводного аспарагиновой кислоты с т. кип. 80- 90° С/1 мм рт. СТ. В результате гидролиза с 97%-ным выходом получена аспарагиновая кислота. Угол вращения исходной аспарагиновой кислоты равен +25,25° (С 1 в воде), для кислоты, полученной после гидролиза, а 26,52° (С - 1 в воде). Пример 3. Суспензию 1,32 г L-триптофана в 2,4 г триметйлсилилдиэтиламина нагревали в инертной атмосфере. При достижении температуры бани (120° С) наблюдалось быстрое растворение триптофана, закончивщееся в течение 5 - 10 мин, отогнано 1,6 мл летучих. Разгонку реакционной смеси проводили при остаточном давлении 10 мм рт. ст, Отбирали 1,72 г фракции -с т. кип. 135 140° с;. После гидролиза выделили триптофан с выходом 95% с углом вращения равным + 10,93° С 0,4 в 1 н. НС1). Угол вращения исходного триптофана +10,93 (С 0,4 в 1 н. ПС1). Пример 4. 3 г ферментолизата дрожжей нагревали в инертной атмосфере с 11,45 г триметилсилилдиэтиламина 2 час при 100 - 105° С при перемешивании, при этом отгонялся весь диэтиламин. После окоичания реакции избыток тркметилсилилдиэтиламина отгоняли при 50° С/20 мм рт. ст. Смесь разбавляли 40 мл сухого эфира и цептрифугировали при 3000 об/мин. Осадок промывали в 40 мл серпого эфира. К объединенному раствору производных аминокислот в эфире добавляли 8 мл воды при перемешивании. Выпавший осадок аминокислот промывали эфиром и бензолом. Промытый осадок суспендировали в бензоле и лиофилизовали. Выход 2,34 г (76%).

Пример 5. Суспензию 2,04 г сухого ферментолизата в 7,67 г триметилсилилдиэтиламина нагревали в инертной атмосфере при 100 - 105° С 2 час при перемешивании. После отгонки избытка триметилсилилдиэтиламина (50° С/20 мм рт. ст.) реакционную смесь перегоняли в вакууме 10 мм рт. ст. Получили 4,73 г светлого прозрачного продукта, который смешивали с 50 мл эфира и гидролизовали добавлением 6 мл воды. Выпавший белый осадок смеси аминокислот обрабатывали аналогично примеру 4. Выход 1,07 г.

Формула изобретения

Способ выделения аминокислот из белковых гидролизатов, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения степени чистоты целевого продукта, указанный гидролизат подвергают взаимодействию с силазаном общей формулы

R

R

(

где R - низший алкил,

и полученные при этом гексаалкилднсилильные производные очищают путем фракционной дистилляции или экстракции неполярными растворителями и гидролизуют добавлением воды или спирта в реакционную смесь.