Способ получения дез-аланин-в-30инсулинов Советский патент 1975 года по МПК C07K14/62 

1

Изобретение относится к способу получения дез-аланин-В -инсулинов, обладающих полной биологической активностью соответствующих природных инсулинов, но отличающихся от них своими иммунохимическими свойствами.

Известен способ получения дез-аланин-б2°инсулинов путем катализируемого карбоксипептидазой А гидролитического отщепления аланина-. от природных инсулинов.

Однако наряду с целевыми продуктами образуется дез-аланин-б °-дез-аспарагин-Л21-инсулин, который трудно отделяется и загрязняет целевые продукты.

С целью цовыщения степени чистоты целевого продукта предлагается гидролиз природного инсулина, катализируемый карбоксипептидазой А, проводить в водном растворе, содержащем 40-60 об. % органического растворителя, например этанола, при нагревании, преимущественно при 30-50°С, с последующим выделением целевых продуктов известным способом.

Пример. 1,2 г кристаллического свиного инсулина при 40°С растворяют в 55 мл 0,1 н. трис-буфера (рН 8,5), приливают 45 мл этанола, нагревают до 40°С, добавляют 1,2 мл суспензии карбоксипептидазы А, содержащей 0,1 г фермента (фирма «Реанал, ВНР) в 4,4 мл, инкубируют 4 час при 40°С, добавляют

еще 1 мл суспензии карбоксипептидазы А и кубируют 3 час при 40°С. К смеси прибавляют 5,7 н. соляную кислоту до рН 3, упаривают до объема 25-30 мл, оставляют на 2-3 час

при О-4°С и отделяют неактивную карбоксипептидазу Л центрифугированием. К фильтрату добавляют сухой трис-(оксиметил)-аминометан до рН 8,0, наносят раствор на колонку (40X3,5 см) с Сефадексом G-25, предварительно уравновещенную 0,05 М раствором бикарбоната аммония, и алюируют этим же буферным раствором, собирая фракции по 5 мл. Содержание белка во фракциях определяют спектрофотометрически при 278 нм. Фракции,

содержащие белок, объединяют и лиофильно высущивают. Выход целевого продукта 1,15 г, При электрофорезе (750 в, 2 час) на бумаге в 0,1 М растворе лимонной кислоты, содержащем 4 моль мочевины, полученный дез-аланинВ °-инсулин движется однородным пятном, подвижность которого аналогична подвижности исходного свиного инсулина. Дез-аланин5 °-инсулин выделен в аналитически чистом виде с выходом, близким к количественному.

Аминокислотный состав полученного дезаланин-б °-инсулина и исходного свиного инсулина определяют на аминокислотном анализаторе тина «Унихром фирмы «Бекман (ФРГ).

Полученный дез-аланин-В °-инсулйн и исходный свиной инсулин содержат в остатках (теоретически) 1,00 (1) и 1,00 (1) лизина; 1,94 (2) и 1,93 (2) гистидина; 1,00 (1) и 1,00 (I) аргинина; 3,00 (3) и 2,93 (3) аспарагиновой кислоты; 1,68 (2) и 1,71 (2) треспина; 2,58 (3) и 2,83 (3) серина; 7,39 (7) и 7,27 (7) глютаминовой кислоты; 0,98 (1) и 1,07 (1) пролина; 4,00 (4) и 4,00 (4) глицина; 1,07 (1) и 2,03 (2) аланина; 5,22 (6) и 5,21 (6) Va цистина; 3,91 (4) и 3,89 (4) валина; 1,75 (2) и 1,71 (2) изолейцина; 6,09 (6) и 6,15 (6) лейцина; 3,80 (4) и 3,79 (4) тирозина и 2,88 (3) и 2,89 (3) фенилаланина соответственно.

При определении содержания аминокислот в остатках для каждого инсулина за единицу цринята /4 содержания глицина. Гидролиз дез-аланин-б °-инсулина (4 мг), катализируемый карбоксипептидазой А и проводимый в 0,1 н. трис-буфере (рН 8,5) в течение 2 час при 37°С, приводит к отщеплению только аспарагииа (0,35 мкм), как С-концевой аминокислоты.

В аналогичных условиях гидролиз свиного

инсулина сопровождается отщеплением аспарагина (0,31 мкм) и аланина (0,47 мкм)-.

Таким образом, нод действием карбоксипептидазы Л в предлагаемых условиях от свиного инсулина отщепляется единственный аминокислотный остаток - остаток аланина, занимающий положение 30 в цепи В.

Предмет изобретения

1.Способ получения дез-аланин-5 °-инсулинов путем гидролитического отщепления аланина-б ° от природных инсулинов, катализируемого карбоксипептидазой Л, отличающийся тем, что, с целью повыщения степени чистоты целевого продукта, гидролиз природного инсулина, катализируемый карбоксипептидазой А, проводят при нагревании в водном растворе, содержащем 40-60 об. % органического растворителя, например этанола, с последующим выделением целевого продукта известным способом.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что процесс ведут при 30-50°С.