Полипептид,обладающий гипогликемической активностью Советский патент 1985 года по МПК C07K14/62 A61K38/28 C12P21/04 

Изобретение относится к новому биологически активному соединению полипептиду, обладающему гипогликемической активностью, которое может найти применение в медицине. В настоящее время в медицинской практике применяют заменитель инсулина человека (инсулин, содержащий в положении в° остаток оксиаминокислоты L-TpeoHHH }) - инсулин I, отличающийся от инсулина свиньи, человека тем, что положение в в е молекуле занимает L-аланин . Цель изобретения - поиск в ряду полипептидов, обладающих гипоглике- мической активностью, полипептидов, более близких по структуре к инсули ну человека. Цель достигается описываемым .полипептидом общей формулы R - R° - R 1л. о К. J где R - остаток молекулы инсулина, содержащей от 1 до 29 амин кислот; R -остаток молекулы инсулина, содержащей от 31 до 51 амин кислот; В Ь серин, обладающим гипогликемической активностью. Ниже показаны структурные различин в положении В между описываемым полипептидом (I), природным ин сулином свиньи (II) и инсулином человека (III). /// // UJLJLM ////// 1 сн-сГ cH-cf Ц ОН т ОН, I ОН ш Описываемый полипептид получают путем ферментативно-химической тра формации легко доступного и выпуск емого в промьшшенном масштабе свиного инсулина по двухстадийной схе Первая стадия заключается в катали зируемом трипсином трансформировани свиного инсулина, протекающем при взаимодействии последнего с эфиром L-серина. Вторая стадия процесса заключается в химическом демаскиро вании сложно-эфирного производного под действием трифторуксусной кисл 3 ы в присутствии анизола в качестве ротектора. Пример. Растворяют 140 мг (1,14 ммоль) гидрохлорида трет-бутилового эфира 0-т рет-бутил-Ь-серина в смеси 300 мкл диметилформамида 200 мкл трис-буфера с рН 5,7, Прибавлением 5 н. NaOH доводят рН до 8,О,смесь выдерживают 10 мин при 20 С, прибавляют к ней 100 мг (17,5 мкмоль) свиного инсулина, предварительно освобожденного от ионов цинка. Прибавлением 50 мкл концентрированной соляной кислоты устанавливают рН 6,3 и вводят 6 мг трипсина и 5 мкл 0,5 М водного раствора хлористого кальция. Смесь выдерживают -24 ч при 24 С, затем подкисляют 50%-ной уксусной кислотой до рН 2,5 и подвергают гель-фильтрации чепез колонку( 2,8 х 100 см) с сефадексом G-50, применяя в качестве злюента 10%-ную уксусную кислоту. После лиофилизации элюата получают 70 мг сложноэфирного производного целевого полипептида (I), которое очищают ионообменной хроматографией на колонке (1,7 х 16 см) с ДЭАЭ сефадексом А-25, применяя в качестве злюента 0,03 М трис-буфер с рН 8,2, содержащий 0,05% ЭДТА и 50% изопропилового спирта. После концентрирования элюата в вакууме раствор (5 мл) обессоливают пропусканием его через колонку (3,5 х 60 см) с сефадексом G-50, предварительно уравновешенную 0,05 М раствором бикарбоната аммония. Полученное после лиофилизации вещество растворяют в 0,4 мл трифторуксусной кислоты, содержащей 0,02 мл анизола, смесь вьщерживают 1 ч при 20 С, охлаждают до - 10 С, прибавляют 20 мл охлажденного диэти- лового эфира, смесь выдерживают 2 ч при - , отделяют вещество, выпавшее в осадок, центрифугированием, растворяют его в минимальном обьеме 10%-ной уксусной кислоты и образовавшийся аств.ор пропускают для окончательного обессоливания через колонку (2,2 X 38 см) с сефадексом G-25, применяя в качестве элюента 10%-ную уксусную кислоту. После лиофилизации получают 15 мг целевого полипептида (I) с электрофоретической подвижностью 1,35 (электрофорез на бумаге Ватман №,1, рН 1,9, 450 В, 7 мА, стандарт отнесения - бис-8-сульфонат В-цепи инсулина свиньи).

Аминокислотный анализ: Asp 3,00 (3), Thr 1,80 (2), Ser 3,80 (4), Gld 7,06 (7), Pro 1,00 (1), Gly 4,00 (4) Ala 1,02 (1), Cys 4,60 (6), Val 3,60 (4), Jle 1,80 (2), Leu 6,00 (6), Tyr 3,50 (4), Phe 2,90 (3), His 2,00 (2) Lys 1,00 (1), Arg 0,95 (1).

Результаты определения С-концевых аминокислот: Ser 0,98 (1), Asn .0,97 (О.

Проведены биологические испытания описываемого полипептида.

Испытания проводили на мышах (сам цы) массой 20-22 г после 20 часового голодания. Животных делят на 6 групп по 10 животных в каждой. Животным первьпс трех групп подкожно вводят по 1, 0,75 и 0,5 мкг инсулина-стаи-, дарта соответственно; мышам 4-ой, 5-ой и 6-ой группы - те же дозы поли пептида (I), Испытуемые препараты вводят в 0,2 мл физиологического раствора. Животных помещают в разделенную на отдельные ячейки термостатированную камеру при и наблюдают за ними на протяжении 90 мин. В каждой группе подсчитывают количество животных, у которых развиваются судороги.

Результаты исследований представлены в таблице.

Таким образом, биологическая активность описываемого полипептида полностью соответствует активности инсулина человека, взятого в качест- ве стандарта (тве. описываемый поли- пептид обладает 100%-ной инсулиновой активностью).

Проведено определение острой токсичности описываемого полипедтида.

Острую токсичность описываемого соединения проверяли на мышах - cai-rцах весом 20-22 г. Испытуемый полипептид вводят однократно подкожно в дозах 0,5, 0,75 и 1,0 мкг/мьшь (2550 мкг/кг массы тела), что превышает диапазон активных лечебных доз (720 мкг/кг). Наблюдения за животными, помещенными в изолированные боксы при температуре 36 С, продолжали в течение 1 ч. Развившиеся в течение этого времени судороги купировали подкожным введением 20%-ного раствора глюкозы и продолжали наблюдение за животными еще в течение суток. Каких-либо отклонений в поведении

мьш1ей подопытных и контрольных rpyn не наблюдали. В указанных дозах препарат не оказывал местного раздражающего действия. При забое животных через после инъекции соединения (I) какие-либо уплотнения, раздражения, инфильтраты в местах введения не выявлены. Изменения в органах и тканях не обнаружены.

Токсическое действие инсулинов связано с их основным биологическим действием - гипогликемическим эффектом.. При передозировке препарата развиваются гипогликемические судороги, гипогликемическая кома.

Проявления токсического действия абсолютно идентичны для инсулинов человека, свиньи и крупного рогатого скота.

Описываемый полипептид в сравнении с полипептидом свиньи является более близким структурным аналогом инсулина человека.

В сравнении с описываемым пойипептидом инсулин человека более труднодоступный и более до- рогостояш 1й препарат, поскольку для получения инсулина человека необходимо использовать в качестве исходного вещества оксиамино- кислоту L-треонин, содержащую два ассиме .рическйх центра (при Ы - vi.j углеродных атомах); при получении описываемого полипептида исходным веществом является оксиаминокислота L-серин, содержащая только один асимметрическ.ий центр (лишь при(/углеродном атоме).

Указанные структурные различия позволяют снизить в два parа побочные реакции рацемизации при получении описываемого полипептида по сравнению с получением инсулина человека.

Сопоставление стоимости оксиаминокислот L-серина и L-треонина пока- .зывает, что описываемый полипептид дешевле инсулина человека более чем в 5 раз.

Получение описываемого полипептида, обладающего гипогликемической 100%-ной инсулиновой активностью, основано на ферментативном превращении инсулина свиньи, который является доступным промышленным продуктом.

Тестирование по судорожному эффекту у мьппей.

Полипептид общей формулы ,1 R- где R - остаток молекулы инсулина, содержащий от 1 до 29 аминокислот; Е остаток молекулы инсулина, содержащий от 31 до 51 аминокислот; ,30 В - L-серин, обладающий гипогликемической активностью. (Л