Способ получения инсулина человека Советский патент 1990 года по МПК C07K14/62 A61K38/28 C07K1/36 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть иснользовано дал получения инсулина че.т1овека из инсулина свиньи о

Цель изобретения - унрощение способа, достигаемое за счет устранения трудоемких операций предварительной обработки инсулина и снятия защитных химических группировок, a также сок ра- щение времени проведения реакции

Способ основан на новом свойстве дрожлсевой карбоксипептидазы-Y превращать инсулин свиньи в инсулин человека в результате обмена остатка аланина, находящегося в положении В 30, на треалин (источник треонина- производное треонина в среде инкубации) в одну стадию без выделения промежуточного продукта,,

Способ осуществляется cлeдi onаnI образоМо

I

Производные инсулина инс-тпе-Ш инс-тре-тре-ОТ ВДи инс-тре-ОСН, где инс-дез-тре (В 30) - инсулин е- ловека, инкубируют с дрожжевой карб- оксипепидазой Y и .производным треонина при рЛ 7,5-10,0. Предпочтительньп.. производным треовдна является трео- шшамид. Реакцию проводят в водной среде, которая может содержать до 50% Объема органического растворителя, причем выбор растворитапя зависит от растворт.юсти компонентов реакционно, среды. Реакционная среда может- также содержать мочевину или .хлорподрат гуанидина в концентрации до 3 М„ Оптимальная концентрация инсу.шша 0,002-0,05 М, фермента треонинаш„а 0,05-3,0 М, температура iU и с. Эти параметры могут варьировать в 1ШФОКИХ пределах и определяются -чсспериментально.

Ю

и М

СМ

П р и мер 1 , Лреара1ченне.1 CHUHCV- го инсулина в HHcyjBiH человека с ис- пс1льзованием в качестве аминного ком ионента теронинамина и с изол- цией в 5 промежуточных: инсулиноам1дов и чос.пе- д дащая дезамидизация в соответсч вии с изобретениемр

К раствору не содержащего динка свиного инсулина (2 м10 в 2 мМ ЭДТЛ Ш 0,1 М КС1 и 1,5 М хпорги.;фата гуани- дина, содержащего 0,5 М треонинамида (5 L-Tpe-NH,) ири рП 7,5 и 25°С добавляют карбоксинептидазу-Y (15 мкМ). Значение рН в ходе реакции пощдержи-- 15 Бается в результате добавления 0,5 М гидрата окиси натрия с использованием рН-статас В ходе реакции отбираются ajuiKBOTbi реакционной смеси в разное время, а сама реакция оста}1авлива-Ю отся в результате гашения спустя 2 ч доведением рН до 1,0-2,0 добавлением 6 М раствора соляной кислоты, Фракд:шо, содержащую инсулин, отделяют от энзима и низкомолекулярных комионентов в 25 результате хроматографирования на колонке 1x30 см, заполненной гом Г-50 мелким с использованием в качестве растворителя 1 М раствора уксусной кислоты, и лиофилизируют ее„ 30 Проведенный согласно описанному 1зыше способу аминокислотного состава лиофилизироваиного инсулина пока- зьгоает, что 78% свиного инсулина расходуется в ходе реакции 35

Дня дальнейшего анализа реагентов, содержащихся в инсулиновой пробе проводят хроматографирование на ионообменном Сефадекса-ДНА . Образец лиофшшзированного инсудшна 40 (75 мг) растворяют в 0,01 М ТРИС, 2,5 М мочевине, 0,05 М NaCl,, прирН7,5 и хроматографируют на колонке, заполненной Сефадексом-ДКА1 А-25 (2,5х х2,5 чем) с.использованием в качестве 4 растворителя того же самого буферного раствора. Инсулин элюируют растворами хлористого натрия с градиентом концен- . траций от 0,05 до 0,30 М в том же буфере, собирают фракции по 8 мл на ко- лонке, заполненной Сефадексом Г-25 и лиофилизируют их„

Профиль состоит из трех пиков. Кроме того, определяются составы аот(но- кислот и состав веществ пиков в резуль тате обработки карбоксипептидазой (см„

т-абл „ 1) о

Поскольку в указанных реакциях участвуют только Оконец цепи В инсулиня

в качестве моде.1:и свиного инсулина исиол1,зуется 11оследоват;:льность -про- циз-ала-ОИ. Аналогичным образом сокращения для других Г роиз1юдных инсулина представляют -npo-jni3-Tpe-OH для инсулина человека (-про-лиз-тре- NIL) для инсули 1амида человека и т.Дс При рП 7,5, которое используется в ходе реакции, при котором амидазная активность карбоксштептидазы-У обычно ниже, чек ее пептидазная активность, образующийся пeптидa 1ид в значительной мере стабилен, поскольку пик I соотво.тствует- примерно 20% всего ко- Л1гчества 1И1сулиновой пробы,,

В процессе реакции превращается примерно 75% исходног о свиного инсулина. Однако, хотя содержание треонина в пике I (3,65) больше, чем 3,0 соответствующее инсулину человека, очевидно, что первоначальный продукт транспепт1щирования (-про-лиз-тре-НН) не является достаточно стабш1ьным ;VIH того, чтобы не 1фоисходипа олигоме- ризация с образованием (-про-лиз-трешр

На первый взгляд образование смеси промежуточных может говорить о том, что в результате описанной ранее стадии дезамидирования посредством карбоксипептидазы-Y не образуется чистый и})сулин человека, поскольку в результате дезамидпрования очевидно следует ожидать получения смеси -про- jn-13-тре-ОН и -про-лиз-тре-тре-ОП,, Однако при обработке вещества пика I с целью дезамидирования согласно изобретению 10 MKl l карбоксипептидазы-Y при рН 10,0 в 0,1 М НС1, 2 мМ ЭДТА в течение 20 мин получают неоясиданно практически чистый инсулин человека„ Этот опыт протекает следующим образом

После отделе1шя прореагировавшего инсу;тина от энзима и низкомолекулярных продуктов хроматографированием на СефадеКсе Г-50 полученный продукт хроматографир тот на ДЕАЕ-Сефадоксе А-25 с использованием способа, аналогично описанному вьш1е„ Продукт реакции элю1-1руется в пике II, что и ожидалось, тогда как непрореагировав Ш11Й продукт (менее 10%) гзлюируется в пике I. Пик III вообще отсутствует, т.е. производные- инсулина, не содержащие лизина, не образ тотся в ходе . Б результате обработки карб оксипептидазами А и Y и трипсином укзанная реакция влияет TLVILKO на соде

51

жание треонина в сколь-нибудь значительной степени о Это находится в сооветствии с ожидаемым отсутствием пеп тидазной активности карбоксипептида- зы-Y при данном значении

Состав аминокислот для пика II, полученного при реакции дезамидиро- вания, близко к составу инсули.на человека: тре 2,87, ала 1,05, ЛИЗ 0,98о Обработка продукта дез- амидирования карбоксипептидазами Y и А и трипсином показывает, что образец содержит 90-96% чистого инсулина человека„ Это утверждение сде. в предположении, что производное инсулина -про-лиз-тре-тре-Ш реагирует практически только при наличии гидролазной активности к пентидил- амиду аминокислоты, а - про-лпз-тре- тре-Ш2 реагирует главным образом при наличии активности Общи выход для превращения свиного инсулина в инсулин человека составляет примерно 30% из расчета на npeBjia- щенный инсулин„

Т а б. д и ц

10

16112

отп-

а

15

20

25

176

Пример 2 о Инcyлинa aiд человека (инс-тре-Ш ) в количестве 11 мг растворяют в 1 мМ ЭДТА и 2 мМ КС (2 мл), рН доводят до 9,0 добавлением 51 мкл 0,5 Н NaOH и вводят в смесь 50 мкл карбоксипептидазы-У (13,6 мг/мл)о Через 15 мин реакцию останавливают введением 25 мкл 6 М НС1, доводя рН до 1,2„ Реакционную смесь разделяют на Сефадексс Г-50 и элюируют 1 М раствором уксусной кислотыо Получают 8 мг инсулина человека (доказано анализом аминокислотного состава)„

Пример 3 о 5 мг метилового эф1фа инсулина человека (инс-тре-ОСИ ) растворяют в 1 мл 0,1 М КС1 с 1 мМ ЭДТА при повышении рН с 4,5 до 8,-5 добавлением NaOHo Этот диапазон рН сохраняют в рН-стате с использованием 0,05 М NaOH в качестве титранта при комнатной температуре о Реакцию начинают добавлением 1 мкг дрожжевой карб- оксипептидазы, растворенной в 10 мкл водЫо За ходом реакции следят с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии Спустя 1 ч 10 мин гид- ротшз заверщаетсяо Реакционную смесь подвергают гель-фильтрации в 30%-ной yKcycHoii кислоте на Сефадексе Выход, определет1ьй с помощью А,, , составил 4,8 мг человеческого инсулина ,

Аминокислотньш анализ состав приведен в табЛо 2 о

Таблица 2

ИзобретеЕ1ие позволяет упростить извсстньп способ получе}шя инсулина человека и сократить время его реализации за счет сокращения LTHCJIH трудоемких опералдйо Формула и 3 о б р т е н и я

Способ получения инсулина человека путем обработки производных инсулина карбоксипептидазой с последующим выделением целевого продукта, о т л и - ч а ю щ ji и с я тем, что, с целью упрощения способа, в качестве производных инсулина используют и 1с-тре- NHg, HHc-Tpe-Tpe-mig или инс-тре-ОСН где „нс-дез-тре (В 30)-инсулин челонека, а в качестве карбоксипептидазы - дрож-жевую карбоксипептидазу-Y, причем обработку проводят в растворе или дис- персии при рН 7,5-10,0.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения инсулина человека из инсулина свиньи. Цель изобретения - упрощение способа. Способ состоит в обработке производных инсулина инс-тре-NH₂, инс-тре-тре-NH₂ или инс-тре-OCH₃, где инс-дез-тре (ВЗО)-инсулин человека, карбоксипептидазой Y из дрожжей, которая катализирует обмен остатка аланина в положении В 30 на треонин. В качестве источника треонина используют его производные, в частности треонинамид. Способ позволяет получить инсулин человека короткой, простой процедурой.