Способ получения ферментов Советский патент 1976 года по МПК C12D13/10 

I

Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промышленности и может быть использовано в производстве ферментных препаратов и других биологически активных веществ, применяемых в вннодельческой, соевой, консервной, фармацевтической, химической промышленности и сельском хозяйстве.

Известен способ получения ферментов, предусматривающий культивнрснэаняе продуцентов, например Aspergiftue foetidus , на питательной среде, содержащей источняки углерода, азота и миндальные соли, отделение клеток мнкросфгаиизмов, возврат их на стадию культивирования с последующим отбором культуральной мшдкости и &ыдвлз нием из нее ферментов.

Однако известным способом нельзя получить ферменты, например п столнтйческие с заданным комплексом.

С целью получения пектолитическях ыентов с заданным комплексом и стабили зации на стадии активного биосинтеза куль лгивирование продуцента проводят при потоve среды, возврат продуцента на культн&ирование осуществляют на стадии максимального биосинтеза ферментов вместе с продуктами ферментативного гидролиза пектинсо- держащего сырья, характерными для данной стадии биосинтеза.

i Целесообразно для получения пектолити ческих ферментов с преобладанием эндополигвлактуроназы из продуктов ферментатив|ного гидролиза п ктвисодержащего сырья использовать со степенью метоксилнрования 5-37% при этсм возврат 1указанного вещества и продуцента осущесг (влять через 9-24 час от начала культивирования.

Для получения комплекса пектолмтичвоких ферментов с преимушествштым содч жанием пекткнэст в д из продукте фер:ментативного гидролиза псжтиисодвржащего сырья используют олигосахариды со степенью метоксилирсжаниа 37-95%, при этом возврат указанного вещества и продуцента осуществляют через 36-64 час от начала культивирсш ания.

;. Для получения комплекса с преобладанием экзопэлигалактуроназы из продуктов ферментативного гидролиза пектинсодержашего сырья используют попигалактуроновые К.ЯСЛОТЫ, :чтом возврат их и гфодуцента 1Х.уществпяют через 72-120 час от начала культивирования. Целесообразно тькже продукт ферментативного гидролиза пектинсодержащего сырь вводить в среду в количестве 1О-40%. Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Культивируют микроорганизм-продуцент периодическим способом-, определяя биологические и физико-химические параметры в процессе выращивания; определяют стадии развития культуры, специфические для образования необходимого ферментативного комплекса, например: 1 - для соковой промышленности; Л - для винодельческой промышленности Ш - для фармацевтической гфомышленности;IV для химической промышленности и сельского хозяйства. В комплексе I определяющими ферментами являются эндополигалактуроназы, во П - кроме эндополигалактуроназ присутствуют пектинэстеразы, в Ш - отсутствуют протеазы при наличии эндополигалактуроназ И пектинэстераз, в IV - определяющими являются экзополигалактуроназы, Каждая стадия развития культуры харак теризуется своими возрастными морфологофизиологическими особенностями. При дости жении необходимой стадии развития культуры, включают проток, состоящий из специфической питательной среды, характерной только для данного конкретного состояния культуры. Скорость протока изменяют от 1/3 до 1/25 полезного об-ьема в час. Для получения необходимого комплекса пектолитических ферменгов проток среды включают на стадии активного биосинтеза заданного комплекса ферментов. , Так .для получения пектолитического комплекса ферментов с преобладанием эндо полигалактуроназы проток среды включают через 9-24 час от начала культивирования продуцента, для повышения содержания пектинэстеразы - через 36-64 час, экзополигапактуроназы через 72-120 час, синХрОННО с притоком осуществляют отбор ГЛУ битшой культуры и возврат части биомассы продуцента вместе с продуктами гидролиза пектинсодержащего сырья, специфичными для получения заданного комплекса ферменТак для получения пектолитического ком плекса ферментов с преобладанием эндопо- лигалактуроназь5 наряду с продуцентом в состив протока вводят олигосахариды со ст ) .-1ИрОВв 1:1Я О-... ,(ЛЯ :й;гИ-1:: ПИЯ содержания пекП-игяпераз : r:i:o.ii-.ivi;i; олигосахаридь со г-теиенью глртокси.пирир,,ния 37-95%, для полумения комплексна г преобладанием экзополигалактурона.чы. используют полигалактуроновые кислоть. При этом продукты ферментативного гидролизе пектинсодержащего сырья вводят в срелу в количестве 10-40%. Пример 1, В ферментер загружают питательную среду следующего состава, в %: Экстракт свекловичного жома89,15 Вытяжка из солодовых ростков 10,0 ( NH ISO,.0,70 КН.,РО Mg-SO -TH O0,05. Стерилизуют и засевают активированными конидиями AspergifEus footidus . на 21; часу развития культуры включают проток в количестве 1/3 полезного объема в час, в состав протока входят следующие компоненты, в %: (NHl SO Вытяжка из солодовых ростков 1О.О Прогидролизованный экстра т свекловичного жома до олигосахаридов со степенью ме токсилирования 5-37%89.15. Одновременно с включением протока синронно отбирают глубинную культуру, фильт.уют, биомассу сушат и количественно включают в состав протока, а из культуральной Ж адкости выделяют ферментный препарат любым L3 известных способов. Ферментативные активности глубинной культуры следующие,. ПГС/В (эндополигалактуроназная акт.)3-4 ПГС/А (эндополигалактурочазная акт/),2 ПЭ {пектинэстеразная акт.)0,0 ПС (протеолитическая акт.) ЗОО-.50О Пример 2. Культивирование roati-ius ... осушествля ют аналогично способу, описанному в примере 1, однако про ток включают на 6 4 часу развитиякультуры в количестве 1/10 полезного объема в час, содержащий экстракт свекловичного жома, Прогидролизованный до олигос:ахаридов со степенью метоксилирования . Далее как в примере № 1. Ферментативные активности глубинной культуры следующие, ед/мл: ПГС/В1,5-2,5 ПГС/Л3-5,0 ИЭ0,7-1.6 ПС40О ек) . П р и мер 3. Периодическое и непрерывное культивирование осуществляют ан способу, описанному в примере 2, включая в проток лакто,зу в количестве 0,5 Получаемые при этом ферментативные акти ности глубинной культуры следующие, ед/м ПГС/В3-5,0 ПГС/В3-5,0 ПЭ0,7-1-6 ПС0,0 Пример 4. Культивирование перио дическое до включения протока и непрерывн после включения протока осуществляют ана логично способу, описанному в примере 1 той только разницей, что проток включают на 11О часу развития культуры со скоростью 1/15 полезного объема ферментера в час и в состав протока включают про гид ро лизованный до полигалактуроновых кислот жом. Получаемые при этом ферментативные активности глубинной культуры следующие, ед/мл: ПГС/В5-7 ПГС/А18-22 ПЭ0,8-1,2 Таким образом, предлагаемый способ {позволяет эффективно решить вопрос получе ния ферментов с заданным комплексом в условиях непрерывного культивирювания, удовлетворяет потребности различных отрас :Лей народного хозяйства (винодельческой, соковой, консервной, фармацевтической про мышленности, сельского хозяйства) Е специализированных высокоэффективных пектолитических ферментных препаратах. Формула изобретения i. Способ получения ферментов, предусматривающий культивирование продуцентов, например Aspergi.Hus j oetidu, на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, отделение клеток микг чь . ; сггади) хультиви 1(члания - г:}-; ч1 - - тбОПОМ КуЛЬТУраЛЬНОЙ .4(Ц;1.)Г l-И I. Bl.I,lt.nrHrie M из нее ферментов, о г л и т я кл щ и и , я тем, что, с целью получения пекто.читических фермрртоп с заданным KoMuaeKcc N и стабилизации процесса на стадии активяо) биосинтеза, культивирование продуцента проводят при протоке среды, а возврат продуценте осуществляют на стадию максимального биосинтеза ферментов вместе с продуктами ферментативного гидролиза пектинсодержашего. сырья, характерными для данной стадии биосинтеза, 2.Способ по п. 1, о т п и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью возможности получения пектолитических ферментов с преобладанием эндополигалактуроназы, из продуктов ферментативного гидролиза пектинсодержашего сырья используют )сахариды со степенью метоксилирования 5-37%, при этом возврат указанного вещества и продуцента осупествляют через 9-24 час от начала культивирования. 3.Способ по п. 1, о т л ь ч -а ю щ и Йс я тем, что, с целью повышения содержания пектинзстеразы в комплексе, из продуктов ферментативного гидролиза пектинсодеожащего сырья используют олигосахариды со степенью метоксилирования 37-95%, при этом возврат указанного вещества и продуцента осутаествляют через 36-64 час от начала культивирования. 4.Способ по п. 1, о т л и ч (j ю щ и йс я тем, что, с целью возможности получения пектолитических ферментов с преобладанием экзополигалактуроназы, из продуктов ферментативного гидролиза пектинсодержащего сырья используют полигалактуроно1вые кислоты, при этом возврат их и проду цента осуществляют через 72-120 час от 1начала культивирования. I 5. Способ по пп. 1-4, отличающийся тем, что продукт ферментативjHoro гидролиза пектинсодержащего сырья вводят в среду в количестве 10-4О%.