Способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов пектолитических ферментов Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 C12N9/16 

1

(21)4775377/13 (22)28.12.89 (46)23.11.91. Бюл.

(71)Всесоюзный научно-исследовательский и проектно-конструкторский институт биологической техники

(72)Б. А. Величко, Г. В. Черкасова, Л. А. Щутова и Т, В. Полянская (53)577.15(088.8)

(56)Авторское свидетельство СССР N 516734, кл. С 12 N 1/14, 1974.

Авторское свидетельство СССР N«558041, кл. С 12 N 1/14. 1975.

(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

(57)Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству лектолитических ферментов. Цель изобретения - повышение активности

пектолитических ферментов. Способ включает следующие операции: приготовление суспензии свекловичного жома и солодовых ростков, введение ортофосфорной кислоты до установления рН 2.8-3,2,нагревание смеси до 125-130°С, выдерживание при этой температуре 2 ч, снижение температуры до 45°С, доведение рН до 4,0, введение пектолитических и целлюлолитических ферментов, выдерживание в течение 1-2 ч до содержания олигоуронидов в среде 220-240 мг/100млсмеси, введение минеральных солей, доведение обьема до заданного, стерилизацию питательной среды и охлаждение ее до 30°С. Рекомендуется при ферментоли- зе пектолитические и целлюлолитические ферменты использовать как в виде готовых форм ферментных препаратов, так и в виде нативной или высушенной биомассы продуцентов указанных ферментов из расчета 1,0- 1,5 и 0,5-1,0 ЕД/г сухих веществ соответственно. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

Ј ,

Ё

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству пектолитических ферментов, и касается способа приготовления питательной среды для глубинного культивирования микроорганизмов-продуцентов указанных ферментов.

Известна питательная среда для культивирования продуцентов пектолитических ферментов, содержащая сахарозу, пектин, пептон, кукурузный экстракт и минеральные соли 1. При культивировании на этой среде микромицетов рода Aspergillus получена пектолитическая активность 320-1200 ЕД/мл по йодометрическому способу определения, что соответствует 0,1-0.3 ЕД/мл по ГОСТу.

Наиболее .близким к изобретению техническим решением является способ приготовления питательной среды для продуцентов пектолитических ферментов, предусматривающий нагревание водной суспензии свекловичного жома, выдерживание и охлаждение ее, удаление твердой фазы, гидролиз пектолитическими ферментами с последующим смешиванием гидро- лизата с минеральными солями 2

Пектолитическая активность полученной культуральной жидкости 360 ЕД/мл.

О

ю

OJ

g

ю

Недостатком известного способа является низкая пектолитическая активность фермента.

Цель изобретения - повышение активности неполитических ферментов.

В суспензию вводят свекловичный жом и солодовые ростки перед нагреванием ор- тофосфорной кислоты до установления рН 2,8-3,2. Целесообразно при ферментативном гидролизе использовать наряду с пек- толитическимиферментами

целлюлолитичзские ферменты, при этом пектолитические и целлюлолитические ферменты вносят в количестве 1,0 - 1,5 и 0,5 - 1,0 ЕД/г сухих веществ соответственно.

Для ферментативного гидролиза смеси свекловичного жома и солодовых ростков используют клеточно-связанные ферменты в виде нативной или высушенной биомассы продуцентов пектолитических и целлюлоли- тических ферментов.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.

В водную суспензию свекловичного жома и солодовых ростков вводят ортофосфор- ную кислоту до установления рН 2,8-3,2, суспензию нагревают до 125-130°С, выдерживают при этой температуре 2 ч, затем охлаждают до 45-55°С. Доводят рН до 4,0. Затем проводят ферментативный гидролиз суспензии свекловичного жома и солодовых ростков. При ферментолизе используют пектолитические и целлюлолитические ферменты в количестве 1,0-1,5 и 0,5-10 ЕД/г сухих веществ соответственно.

Ферментативный гидролиз проводят в течение 1-2 ч до содержания олигоуронидов в среде 220-240 мг/100 мл.

Полученный гидролизат смешивают с минеральными солями. Готовая питательная среда стерилизуется и используется для засева продуцентом пектолитических ферментов.

Предварительная тепловая обработка в присутствии кислоты способствует разрушению клеток растительного сырья, обработанный таким образом субстрат более доступен для действия ферментов.

Сочетание кислотного и ферментативного гидролиза обеспечивает полный переход протопектина в пектин и ферментолиз последнего до олигоуронидов - индуктора биосинтеза пектолитических ферментов.

Использование целлюлолитических ферментов при ферментолизе свекловичного жома (содержание целлюлозы до 70%) позволяет провести ферментолиз целлюлозы до образования олигосахаридов, что позволяет сократить лаг-фазу и получить более высокую скорость роста продуцента.

Значения рН 2,8-3,2 для проведения кислотного гидролиза являются существенными, поскольку именно в этом пределе рН образуются продукты фосфоролиза. которые являются стимуляторами биосинтеза пектолитических ферментйв.

Дозировки ферментов для гидролиза подобраны экспериментально.

Пример 1.3г свекловичного жома и

0 1 г солодовых ростков заливают 100 мл воды. Доводят ортофосфорной кислотой рН суспензии до 2,6 и нагревают до 125-130°С, выдерживают смесь при этой температуре 2 ч, затем охлаждают до 45°С. Доводят рН до

5 4,0. Вводят ферментный раствор Пектофое- тидина ГЗх из расчета 1,0 ЕД/г сухих веществ и проводят ферментолиз в течение 2 ч (содержание олигоуронидов 220 мг/100 мл. Полученный гидролизат смешивают с

0 минеральными солями. Готовую среду стерилизуют, охлаждают и используют для культивирования продуцента A foetidus M- 45. Пектолитическая активность культурэль- ной жидкости 6,3 ЕД/мл.

5 П р и м е р 2. Аналогично примеру 1. только рН суспензии перед нагреванием доводят до 2,8. Содержание олигоуронидов 219 мг/100мл. Пектолитическая активность культуральной жидкости 63 ЕД/мл.

0 ПримерЗ. Аналогично примеру 2, только рН суспензии перед нагреванием доводят до 3.0. Содержание олигоуронидов 210 мг/100мл. Пектолитическая активность культуральной жидкости 7,0 ЕД/мл.

5 П р и м е р 4. Аналогично примеру 2, только рН суспензии перед нагреванием доводят до 3,2. Содержание олигоуронидов 202 мг/100 мл. Пектолитическая актив- ность культуральной жидкости 6,7 ЕД/мл.

0 П р и м е р 5. Аналогично примеру 5, но продуцент A awamorl 16. Пектолитическая активность культуральной жидкости 6,1 ЕД/мл.

Пример 6. Аналогично примеру 2,

5 только рН суспензии перед нагреванием доводят до 3,4. Содержание олигоуронидов 151 мг/100 мл. Пектолитическая активность культуральной жидкости 5,2 ЕД/мл,

Пример 7. Аналогично примеру 4,

0 только перед ферментативным гидролизом вводят Пектофоетидин ГЗх и Целловиридин ГЗх из расчета 1,0 ЕД/г сух их веществ и 0,3; 0,5; 0,7; 1,0 и 1,2 ЕД/г сухих веществ соответственно1.

5 Полученные пектолитические активности приведены в табл. 1.

Пример 8. Аналогично примеру 3, только перед ферментативным гидролизом вводят Целловиридин ГЗх и Пектофоетидин ГЗх из расчета 0,5 ЕД/г сухих веществ и 0,7:

1,0; 1,3; 1,5; 1,7 и 2,0 ЕД/г сухих веществ соответственно.

Полученные неполитические активности приведены в табл, 2.

Пример 9, Аналогично примеру 3, только перед ферментативным гидролизом Пектофоетидин НЗх из расчета 1,0 ЕД/г сухих веществ и биомассу Т. vlride 13/10 из расчета 0,5 единиц активности клеточно- связанных целлюлолитических ферментов на 1 г сухих веществ. Содержание олигоуро- нидов в готовой среде 239 мг/100 мл. Пек- толитическая активность культуральной жидкости 8,0 ЕД/мл.

Пример 10. Аналогично примеру 3, только перед ферментативным гидролизом вводят Целловиридин ГЗх из расчета 0,5 ЕД/г сухих веществ и биомассу A foetldus М-45 из расчета 1.0 ЕД неполитической активности клеточно-связэнных ферментов на 1 г сухих веществ. Содержание олигоурони- дов 239 мг/100 мл. Пектолитическая активность культуральной жидкости 8,2 ЕД/мл.

Пример 11. Аналогично примеру 3, только перед ферментативным гидролизом вводят биомассу Т. viride 13/tO и биомассу A. foetidus М-45 из расчета 0,5 и 1,0 ЕД/г сухих веществ соответственно. Содержание олигоуронидов 233 мг/100 мл. Пектолитическая активность культуральной жидкости 8,5 ЕД/мл.

Пример 12. Аналогично примеру 11, только продуцент A. awamori 16. Пектолитическая активность культуральной жидкости 7,0 ЕД/мл.

Формула изобретения 1. Способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов пектолитических ферментов, предусматривающий разваривание пектинсодержащего сырья, охлаждение суспензии и ферментативный гидролиз пектолитическим ферментом с последующим смешиванием гидролизата с минеральными солями и стерилизацией среды, отличающийся тем, что, с целью повышения активности пектолитических ферментов, развариванию подвергают смесь свекловичного жома и солодовых ростков при рН 2,8-3,2, установленном ортофосфорной кислотой, а ферментативный гидролиз ведут в присутствии целлюлолитического фермента, при этом целлюлолитические и пектолитические ферменты вносят в количестве 0,5-1,0 и 1,0-1,5 ЕД/г сухих веществ соответственно,

Таблица 1

Таблица2