Способ выращивания вируса ящура Советский патент 1976 года по МПК C12K1/00 

(54) СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ ВИРУСА ЯЩУРА

щают в приготовленный для купьтивироваиин, вирусов ферментер, содержащий необходимую пропорцию питательной среды.

В качестве питательнэй среды используют физиологический раствор с рН 7,4-7,6 следующего состава, г: NaC 720, К C-t 18, CaC-t -bHaO 18, MgWa..09, NaWa, О ИД.аНСОз 200 Waa,HP04,5Hj048,06, глюкоза ЮО пептон 24О, касайнгидролизат ЗОО, DL - метионин 12,8,DL - трипто-: фан 8,0,I)L- TpeoHJ-ra 2,5,L-- цистин HCi 5,2,..р тироксин О.ОООЭДЬСа пантотенат О,О32, ниацин ОД6, хлорамфеникол 1О, пеницилин 32, неомицин- сульфат 1О, поли- миксин В 0,5I j нистатин 0,75. 1 Кроме того, среда содержит О,02%-ный растеор гемина 3,6 мл, инсулина80 36. и 10О л дистиллированной воды.

Исходную смесь для выращивания после добавления суспензии ткани с вирусами | ycTai-швливают при помощи гпикокол-буфера ка| значение рН 7,4-7,6 и размешивают при и с 25 об/мин.

Гликокол-.буфер имеет следующий срстав, г: гл1{кокал 158,Na,C- l-4,NaOH eljr, а также дистиллированной воды 100(5. мл.

Одновременно в исходную смесь вводят для выращивания стерильно отфильтрованныйчистый кислород (2 м/мин). Значение рН исходной смеси непрерьшно контролируют и,; если .необходимо, регулируют добавляя гли-i жокол- буфер на значение рН 7,4-7,6.

Через 18-24 час, в зависимости от типа вируса, прекращают вьфащивание вируса и охлаждают суспензию до 4 С. Затем содержащие в:фус ткани (ткани рубца и эпителиальные клеткн языка) размельчают при помощиКОЛЛОИДНОЙ мельницы, чтобы получить находящие-л в клетках . Вскрытую таким образом ткалевую массу вместе с содержащей аирусы средой для выращиэания экстрагируют, медленно размешивая (35 ), в течение 1 час при 4 С. В . суспензию ткаьш добавляют мертоган (Тиме-, розал}, с коицентрадией 1:40ООО;или 0,2 i 1% хлорофорьш.-. ,

После зкстрактжи суспензию вирус эв, цеН трифугируют в непрерывно действующей цен-: тряфуге. Полученный таким образом прозрач- ный экстрат вирусов после количественного отцепенив его антигенного содержания вирусов , йщура может применен как антиген для изготовления вакцины против ящура.

Определение содержания В1фуса, а именно; содержание инфекциозных антиген и компле-, мектр связывающих антиген, происходит ко- личественно.

Содержание инфекционного ант1П ена определяют на мыщах следующим образом.

Каждые Ю мыщейв возрасте 4 - 7 дней получают под эфирным наркозом О ДО мл

-7

разжижения вирусов 1О , Ю,Ю 10 , 1 р внутрнбрющную инъекцию.Опьгг продолжается 7 дней. Смертные случаи до истеченич 48 час после инфекции не принимаются во внимание, так как инкубационный период продолжается 48 час.

Содержание комплементр-связываюишх антиген определяют количественно серологически а реакции связьшания комплемента при помощи спектрофотометрического анализа.

Пример.

15 кг ткани рубца и 15 к эпителиальных клеток языка, очищенных облучением ультрафиолетовых лучей, собирают в изотонический, содержащий антибиотик, солевой раствор и размельчают в мясорубке.

Полученную таким образом тканевую массу промывают физиологическим раствором и затем встряхивают в течение 1 час с изотоническим, содержащим антибиотик, солевым раствором. Затем солевой раствор отделяют декантированием и тканевую массу инфицируют ЗО кг суспензии вируса ящура, южно-американского типа вируса С, титр вируса которого составляет КъЬВ 10

После адсорбции в течение 20 мин инфицированную тканевую массу в стерильных условиях помещают в ферментер, наполненный 240 кг питательной среды. Питательную среду перед тем нагревают до 37 С. Исходную смесь для вьфащдвания при помощи 25О мл гпикоко/Ьбуфера устанавливают на значение рН 7,5 и размешивают приЪ7°С и с 25 об/мин. В течение всего процесса вьфашивания в тканевую суспензию пропускают стерильно фильтрованный чистый кислоРОД (2 л/мин). Значение рН постоянно контролируют: через 5 час и через 8 час после инфицирования, устанавливают дополнительно, добавляя по 300 мл, а через 14 час после инфицирования, добавляя 400 мл глихокол-буфера на значение рН 7,4.

После 12 час инфицирования (с промежутком в 2 час) до 22 час после инфицирЬ вания отбирают пробы для количественного определения содержания инфекциозных и ком- плегленто-связывающих антигенов. Выращивш1ие прекращают через 22 час, и исходную смесь охла вдают до 4 С, Части ткани исходной смеси для выращивания при помощи коллоидной мельницы открывают для конечной экстракции вируса.

Обработанную таким образом тканевую массу вместе с содержащей вирус средой для выращивания экстрагируют в течение 1 час при 4 С, медленно размещивая /35 об/мин/. После экстракции суспензию вирусов центрифугируют . Б непрестанно действующей центрифуге. В полученную таким образом прозрачную суспензию вируса добавляют мертагов в концентращ1и 1 : 40000. Титр вируса и титр кэмппвментэ-сБязываюшего антигена развиваются в течение 22 час процесса /табл.1/. Пример 2. Согласно примеру 3. из эпителиальных клеток язьпса крупного рогатого скота и ткани рубца получают суспензию и инфицируют ее южно-американским вирусом ящура типа О, подтип О - Canipcb(iHTp вируса Mi)l.l}5Q ). : Выращивание вируса прекращают после ; 20 час. Развитие титра вируса и титра ком1 плементо-связывакицего антигена проходит ; следующим образом (табл. 2). Пример 3. Согласно примеру 1 из ткан„ рубца и эпителиальных клеток языка крупного рогатого скота изготовляют суспен|зию ткани и инфицируют южнэ-американским вирусом типа А подтип А,-(титр, вирусаiMbLDyolCT i. : Через 24 час выращивание прекращают и собирают вирус. Развитие титра вируса и титра кэмплементэ-связывающего антиге|на проходит следующим образом (табл. 3). j Полученные по примерам 1, 2, 3 суспен зии вируса применяют в качестве антигена ;вируса ящура -. трехвалентной вакцине проITHB яшура. ; Вакцина защищает рогатый скот против -искусственного заражения примененными для ;ее изготовления тремя типами вируса О Cawpos j j, и С. ( Предлагаемый способ позволяет использовать в качестве вируса ящура, например, {европейские О, А и С, южно-американские О, А и С, африканские SAT 1,2 и 3, а также |азиа7ч:кие типы, например ЛбШ 1, и все под|типы названных основных типов вируса. Таблица 1

Таблица 2

Формула изобретения Спэсоб выраишвания вируса яшура, вклю чаюшиЙ его культивирование на суспензии переживающих клеток слизистой желудка жвачных преимуи1ественно крупного рогатого скота с последуюишм выделением, о т л и-v

510138

8 Таблиц n 3

чающийся тем, что, с целью поъы-тения выхода целевого продукта, культивирование вируса проводят на указанной суспензии, смешанной с суспензией переживающих клеток эпителия языка крупного рогатого скота..