Способ выделения рибонуклеиновой кислоты из митохондрий Советский патент 1976 года по МПК A61K38/16 

Изобретение относится к области биохимии и jMOKCT найти примеиение для аналитического изучения и для ирепаративного иолучения рибонуклеиновой кислоты (РНК).

Известен способ выделения РНК из митохоидрий, заключающийся в гомогенизации тканей, центрифугировании, осаждении митохондрий из надосадочной жидкости, повторном центрифугировании для очистки от примесей и ресуспендировании в депротеинизирующих смесях 1.

Целью изобретения является выделение недеградированной РНК.

Это достигается тем, что гомогенизацию тканей проводят в буферном растворе, содержащем 1-ilО уИ.иоугем хлористого магния и ингибиторы рибонуклеаз, например смесь 0,01 - 0,1% яоливинилсульфата и 0,01-0,1% макалоида, очистку проводят в тех же растворах, дополнительную очистку проводят путем центрифугирования через 5-10%-ный раствор фиколла (ИЛИ обработки 0,1-0,2%-ным дигитояином, выделение РНК проводят при О- 2° С и для депротеинизации используют смесь февол-хлороформ (1 : 1 по объему).

Пример 1. Печень крыс извлекают и гомогенизируют в 0,01 моля трис-НС буфере, рН 7,4, содержащем 0,25 моля сахарозы, 1 ммоль хлористого магния и смесь 0,5% поливинилсульфата и 0,5% макалоидасинтетических ингибиторов рибонуклеаз. Гомогенат дважды центрифугируют при 500 g в течение 10 мин для удаления примесей целых клеток и ядер.

Из полученной надосадочной жидкости митохондрии осаждают центрифугированием при 7500 g в течение 10 мин. Осадок Митохондрий ресуспендируют в среде выделения и повторно переосаждают центрифугированием в тех же условиях. Эту процедуру очистки повторяют еще дважды. Выделенцые .мито.хоидрнн подвергают дополнительной очистке. Для этого их суспендируют в среде выделения и наслаивают па 7%-пый раствор фиколла, при5готовленного на среде выделения, а затем центрифугируют при 15000 g в течение 10 мин. Все операции по выделению и очистке митохондрий проводят при О-2° С. Из конечных суспензий митохондрий отбирают алнквоты для -определения количества белка и РНК,

0 онределения дыхательной активности митохондрий и активности маркерных ферментов макросом и лизосом.

Для выделения РНК .митохондрии суспен5дируют в 0,01 моля калийацетатно-м буфере, рН 5,1, содержащем 1% додецилсульфата натрия Н смесь 0,5% поливинилсульфата и 0,5% Ма калоида. iK полученной вязкой суопеогзии добавляют равный объ0ем смеси фенол-хлороформ (1:1 по объему)

и встряхивают на качалхг при 2°С в течение 10 мин. Фазы разделяют центрифугирозанмем при 5000 об/мин в течение 20 мин. Нижн.ак органический слой удаляют шприцем, а лрэмежуточ:ный и водный слои повторно экстрагируют смесью фенол-хлороформ. После улалеиия органического слоя промежуточный и водный слои экстрагируют носледовательно 4 раза хлороформом, встряхивая смесь при 2° С в течение 5 мин. Фазы разделяют центрифугированием |дри 5000 з течение 15 лшн. В процессе очистки промежуточный слой .полностью исчезает. РНК из водного слоя осаждают 2 об. холодного этанола, содержащего 0,1 моля хлористый натрий. Осадок РНК растворяют в 0,01 моля калий-ацетатном буфере, рН 5,1, определяют количество И фра1кционируют в 5-20%-ном линейном градиенте сахарозы, приготовленном на 0,01 моля кал:ий-а цетатном буфере, рН 5,1, содержащем ПО 1.00 мкг/л поливннилсульфата и макалоида, .0,1 моля хлористого натрия и 0,05% додецилсульфата натрия.

.При выделении РНК этим способом не наблюдается приз,накО:В деградации митохондрлальной РНК.

Пример 2. .Печень крысы извлекают и гомогенизируют в 0,05 моля трис-ИС буфере, рН 7,4, содержащем 0,25 моля сахарозы, 10 ммоль хлористого магния и природный ингибитор рибонуклеаз. Природный ингибитор рибонуклеаз выделяют из печени хрысы. Для этото печень гомогенизируют в 10 ммолях трис-НС буфере, рН 7,4, содержащем 0,3 моля сахарозы, 2,5 ммоля хлористого каьТИя и 25 ммоля хлористого магния. На 1 г веса печени берут 4 мл среды выделения. Полученный гомогенат центрифугируют при 12000 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость центрифугируют При 360000 g 2 час. Полученный супернатаит является ингибитором рибонуклеаз. При выделении митохондрий его добавляют в среду выделения в соотнощении 1:1.

При выделении митохондрий гомогенат центрифугируют при 1000 g в течение 10 мин для удаления примесей целых клеток и ядер. Из полученной надосадочной жидкости митохондрии осаждают при 11000 g в течение 10 мин. Трижды проводят дополнительное переосаждение митохондрий в тех же условиям. Выделениые митохондрии подвергают дололн;1тельпой очистке путем обработки дигитоннном. Для этого к митохондриям, суспендироза П ым в минимальном объеме (около 100 мг митохоидриального белка/мл), добавляют раствор дигитонина до .конечной концентрации 1,5 унг/100 мг белка митохондр.ий. Раствор дигитони:на готовят непоаредственно перед опытом на среде выделения в концентрации 15 мг1мл. Митохондрии выдерживают с дигитонином 15 мин при 0° С и, разбавив средой выделения, осаждают при 8000 g в течение 10 мин. Операции цо выделению митохондриальной РНК те же, что в примере 1.

Формула изобретения

Способ выделения рибонуклеиновой .кислоты из митохоидрий, заключающийся в гомогенизации тка.ней, центрифугировании, осаждении митохондрий из надосадочной жидкости, повторном центрифугировании для очистки от примесей и ресуспендировании в депротеинизирующих смесях, отличающийся тем, что, с целью Выделения недеградированной рибонуклеиновой-кислоты, гомогенизацию тканей проводят в буферном растворе, содержащем 1 -10 ммолей хлористого магния и ингибиторы рибонуклеаз, например, смесь 0,01 - 0,1% поливинилсульфата и 0,01-0,1% макалоида, проводят очистку в тех же растворах, дополнительную очистку и выделение рибонуклеиновой кислоты цри 0-2° С И для депротеинизации используют смесь фенол-хл.ороформ (1:1 по объему).

2.Способ по п. 1, о т л ич а ю щ и и с я тем, что дополнительную очистку проводят путем центрифугирования через 5-10%-ный раствор фи1колла.

3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительную очистку проводят путем Обработки 0,1-0,2%-ным дигитонином

Источник информации, .принятый во внимание при экспертизе:

1. «Молекулярная биология, 1969, № 3, с. 315-321 (прототип).