Способ получения модифицированнойРибОНуКлЕиНОВОй КиСлОТы Советский патент 1981 года по МПК C07H21/00 

фицированных нуклеиновых кислот иедостаточно высок (менее 20%).

Целью изобретения является увеличение выхода растворимого лиганда, а также отделение его от побочных продуктов синтеза.

Поставленная цель достигается согласно описываемому способу получения модифицированной рибонуклеиновой кислоты, заключающемуся в связывании РНК с полиглюкином с помощью пианурхлорида в течение 24 ч при 20-25°С путем обработки 1,5-2% смеси РНК и полиглюкина ацетоновым раствором циаиурхлорида (при концентрации его в смеси 0,05-1%), с последующим удаление.м водонерастворимых продуктов реакции, диализом против 0,05 М трис-НС1 буфера рН 7,0-7,5 и селективны.м извлечением целевого продукта аффинной хроматографией.

Существенны.ми отличиями данного способа являются низкие концентрации реагирующих веществ, условия связывания - в течение 24 ч при 20-25°С, диализ и селективное извлечение целевого продукга, проводимые в указанных выше условиях.

При осуществлении способа весовое соотношение РНК и полиглюкина обычно составляет 1 : 10, а в качестве аффинного сорбента используют рибонуклеазу, иммобилизованную на оксиэтилсульфониланизолцеллюлозе.

Описываемый способ обеспечивает более высокий выход модифицированной РНК, а также высокое качество продукта. достигаемое за счет применения в целях очистки и выделения афинной хроматографии.

Модифицированная РНК, получаемая описываемым способом, сохраняет способность к повторному взаимодействию с ферментом и может быть использована в качестве специфического ингибитора РНКазы

Молекулярный вес лиганда можег колебаться в широких пределах (в зависимости от молекулярного веса носителя), это .может быть использовано для получения комплексов ингибитор-РНКаза и выделения фермента из сложной смеси белков с близкими физико-химическими свойствами методо.м эксклюзионной хроматографии.

Способность образовывать достаточно прочные комплексы с ферментом может быть использована для защиты активного центра фермента при его иммобилизации. При этом увеличится выход и.ммобилизованкых ферментов.по активности и, естественно , возрастет экономическая эф.})ективность иммобилизации. Иммобилизованные на растворимых носителях ферменты обладают более высокой биологической активностью, и их целесообразно использовать в качестве лекарственных препаратов по сравнению с нативными ферментами.

Пример 1. 500 мг полиглюкина растворяют в 25 мл 0,1 М боратного буфера, рН 9,2, в полученном растворе растворяют 50 мг РНК, смесь охлаждают до 5 Далее добавляют 10 мл о.хлажденного раствора цианурхлорида в ацетоне (2,5 мг/мл). Температуру смеси доводят до ко.мнатнон, выдерживают в течение 24 ч. Водонераствори.мые продукты отделяют фильтрованием. Водорастворимый продукт, выход которого

составляет более 40%, далее отдиализовывают против 0,05 М трис-НС1 б фера, рН 7,0-7,5 до удаления низкомолекулярных примесей, поглощающих при 260 нм.

Диализат наносят на колонку с и.м.мобилизованной на оксиэтилсульфониланизолцеллюлозе РНКазой в соотношении 25 опт. ед. на 100000 ед. акт. иммобилизованного фермента. Активность исследуют методом определения продуктов гидролиза РНК, растворимых в кислом растворе уранилацетата (конечная концентрация - 0,12% уранилацетата в 4% НСЮ4). За единицу активности принимают количество .фермента, образующего 1,0 опт. ед. кислоторастворимых продуктов гид|)ол11за РНК в течение 1 часа инкубации )еак11ионной смеси. Колонку промывают 0,05 fA трис-НС1 буфером рН 7,5 и водорастворимый лиганд РНКазы элюируют 0,2 М ацетатным буфером, рН 5,2.

Пример 2. Использование модифицированной РНК в качестве ингибитора РНКазы.

Ингибирующее действие модифицированной РНК (высокомолекулярного лиганда) определяют по торможению )еакции гидролиза РНК в присутствии модифицированной РНК с помощью метода измерения количеств кислоторастворимых продуктов гидролиза.

Реакционную смесь, состояш,ую из 0,1мл РНК (концентрация 1 мг/мл), 0,1мл фермента - панкреатической РНКазы и 0,1 мл ингибитора, инкубируют при 37°С в

течение 5, 10, 15 мин. Затем к ней при охлаждении (0°С) добавляют 0,3 мл 0,075%ного )аствора уранилацетата в 10%-ной хлорной кислоте. Смесь выдерживают на льду в течение 10 мин. Далее добавляют

1,9 мл 2,5%-цого раствора хлорной кислоты ц отделяют осадок центрифугированием при 7000 об/мин в течение 10 мин.

Оптическую плотность надосадочной жидкости измеряют при 260 нм. За единицу активности принимают количество фермента, образующего 1,0 опт. единиц кислогорастворимых продуктов гидролиза РНК в течение 1 ч инкубации реакционной с.меси.

Наличие в реакционной смеси модифицированной РНК в соотношении к нативной, как 1 : 20, вызывает торможение реакцци гидролиза на 50%.

Формула изобретения

1. Способ получения модифицированной рибонуклеиновой кислоты (РНК) путем .обработки смеси РНК и полиглюкина ацетоновым раствором циаиурхлорида, отличаю HI и н с я тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, используют ци.анурхлорид при концентрации его в реакционной смеси 0,05-1%, РНК и иолиглюкина 1,5-2%, связывание осуществляют в течение 24 ч при 20-25°С с последующим удалением водонерастворимых продуктов ооакции, диализом против 0,05 М трис-НС1 пуфера, рН 7,0-7,5 и селективным извле6

чением целево продукта аффинной -хроматографией.

2.Способ по IT. 1., о т л нч а ю щ и и с я тем, что весовое соотношение РНК и полиглюкина в реакционной смеси составляет 1 : 10.

3.Способ по п. 1, о т л 11 ч а ю щ и ii с я тем, что в качестве аффинного сорбент-а используют рибонуклеазу, иммобилизованную на оксиэтилсульфоняланизоцеллюлозе.

Источники инфйрмации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР № 618380, кл, С 307 Н 2Ит, J:976 (прототип).