Способ получения протеиносодержашего вещества Советский патент 1976 года по МПК C12D13/06 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНСОДЕРЖА1ЦЕГО ВЕЩЕСТВА

Из вида gram kiearum используют штамм Schwabe, депонированный в Микологическом институте Ьританского содружества за № Ш1 145425, его варианты и мутанты.

Кроме вида graminearuro используют

штаммы за N 1М1 154209, 1М1 154211, Ш1 154212, Ш1 154213, Ш1 154210.

Штамм Fusarium aminearum:fflBa6e 1М1 145425 непатогенен относительно пшеницы и обладает следущими морфологическими свойствами.

/ Среда. Картофельный агар с сахарозой Чапек-Докс (модифицированный агароксоинд). 250 г картофеля промьтают, нарезают мелкими кусками, помещают в пресс-варильник на 15 мин под давлением 10,3411-10 н/м. Отвар фильтруют через два слоя муслина. В мутный фильтрат добавляют 2% глюкозы и 2% агара, после чего среду автоклавируют и диспергируют.

Условия роста. Несколько недель при 25° С. Скорость роста 4,0 см за 3 дня, 3,0 см - за 3 дня.

Характер роста. Хлопьевидные, распространенные колонии с белым воздушным мицелием. Субстрат на картофельном агаре с сахарозой - серовато-розовый q кусочками от малинового до желтого. Тенденция к соломенно-желтол цвету на агаре Чапека-Докса. Иногда образуется темноКрасньш пигмент (в особенности при старении).

После одной-двух недель воздушный мицелий склонен к окрашиванию в бурьш (коричневый) цвет и сплющиванию. Колонии становятся слизистыми при образовании спородохий и цветом от розового до коричневого на КСА (картофельном агаре с сахарозой) и оранжево-розовыми на ЧДА (агаре Чапек Докса).

Эксудат не образуется, а образование пигмента соответствует окрашиванию мицелия.

Конидии. Микроорганизмы не образуют микроконидий. Микроконидии образуются из отдельных боковых стеригм или разветвленных конидиофор с короткими стеригмами. В старых культурах конидиофоры агрегируются с образованием спородохия (в особенности на ЧДА). Кониди различны: от серповидных до изогнутых дорзо-вентральных перегородок от 3 до 5, в более молодых культурах обычно до 5.

Размеры спор колеблются от 25-50x2,5 до 4,0 мкм.

Опорная клетка часто снабжена ножкой (в особенности у длинных с 5 перегородками спор). В мицелии присутствуют разбухшие клетки и иногда включены хламидоспоры, отдельные или цепочки.

Далее приводится пример получения вариантов (или изолятов) штамма Fusarium draminearum Швабе 1М1 145425 и их морфологические особенности.

Изоляты, полученнью на непрерывной культуре Fusarium graminearum Швабе 1М1 154 - 209 до 1М1 154213 отбирают с пластинок солодового агара, инокулированных бульоном из фepмeнJeJ)a, в котором выращивают Fusarium graminearum Швабе

154245 на глюкозе солевой среде при 30° С пук непрерьганых культуральных условиях с лимитированием зглёрода при скорости разбавления0,1-0,15 час7.

Из ферментера отбирают пробы с интервалами, примерно, в 100 час для определения вариантов. Изоляты Ш1 154209-154213 отбирают с пластин, приготовленных с И 00 час образца. Эти изоляты представляют главные виды морфологического варианта, полученного в процессе ферментации. В приведенных в примере условиях варианты появляются на пластинах послеоии час. С этого времени они вепрерьшно образуются, и по1Гуля1Ц1и медленно меняется в процентах каждого вида.

При зтом используют в ферментере культуральную среду состава,%:

Раствор 1.

Глюкоза3,0

Сульфат аммония0,25

Монокалийфосфат

ИЛИКН2Р040,3

Против ОБ шениватель-полипроаиленгликоль 2000,стерилизованный При рН 3,0 в течение 30 мин при 10,341 МО н/м 0,01 Раствор 2.

MnSO44H200,0005

FeS047H200,0005

ZnSO4 7Н2О0,0005

CoCl26H2O0,0001

CuS045H200,0001

Na, .,00,0001.

Стерилизуют в течение 15 мин при 10,3411 н/м Раствор 3.

Биотин0,10 или 20 мкг/л

Холин0,1или2мг/л

МетионинО или 600 мг/л.

Стерилизуют раздельно путем фильтрации. Все растворы вносят а септически в резервуар, помещенный в хемостат емкостью 8,5 л при следующих условиях роста.

Температура 30°С, аэрация 1 объем/м, перемешивание при 800 об/мин на турбинно-дисковой мешалке с 6 лопастями в ферментере с отбой1шком.

В ферментере поддерживают рН 5,0 путем автоматического добавления -стерильного аммиака. Состав раствора 3 меняют через различные интервалы времени для определения максимума различными добавками, например, биотина или биотина схолином.

ъкорость роста 0,1 -0,15 час. Пять изолятов имеют следующие морфологические свойства.

Среда. Картофельный агар с сахарозой

Агар Чапек-Доке (оксоид). Промывают 250 г картофеля, измельчают, помещают в пресс-варильник под давлением 10,3411-10 н/м на 15 мин.

Отвар пропускают через двойной слой муслина.

В мутный фильтрат добавляют 2% глюкозы вместе с 2% агара, после чего среду автоклавируют и диспергируют.

Условия роста; 25° С.°

Характер роста. Fusarium graminearum Schwab NMMl 154209.

Колония морфологически аналогична исходной A3/5 за исключением того, что диаметр колонии Меньше и равен 1,5 см через 3 дня при 30° на ЧДА. Хлопьевидный воздушный мицелий различен в колония:х, но меньше чем у № IMi 154211. Старые культуры обнаруживают поб5фение мицелия.

С обратной стороны желто-бурые до серо-розовых секторов с некоторой пигментацией. Fusarium graminearum Schwabe № 1М1 154211.

Интенсивный белый с хлопьевидным опушением воздушный мицелий. Диаметр колоний меньше, чем у исходной A3/5,2 см через 3 дня при 30° ha ЧДА. С обратной стороны сегменты от оранжево{юзового до серовато-розового...

Fusarium graminearum Schwabe № 1М1 154212. Микроскопически похож HaFusarium gramiinearum IMl 154211, но собратной стороны светлее (от оранжево-розового до прозрачного).

Fusarium graminearum Schwabe NMM1 154213. Небольшие колонии куполообразной формы. Мицелий короткий, спутанный, со склонностью к образованию спиралей. Многие спородохийобразцьш структуры имеют розоватый вид у начала полосы. Розовая окраска на периферии. Диаметр колонии в,4 см через 3 дня при 30° на ЧДА.

Fusarium graminearum Schwabe № 1М1 154210.

Вид очень нестоек и непрерывно меняется до вида 1М1 154213. Похож на 1М1 154209, колонии имеют несколько больший диаметр (2,4 см через 3 дня и более). Вид 1М1 154210 более стоек,.чем 1М1 154213.

Конидии. . Fusarium graminearum Schwabe № 1 Ml 154209.

Образуются обильныемикроконидии аналогично исходному АЗ/5.

В старых культурах образуются, спородохии. Индивидуальные макроконидии похожи на исходный АЗ/5 по форме и размерам, 25-50;3,0-5,0 мкм, Б- старых культурах образуется много спородохии.

В мицелии этого вида обильны хламидоспоры, интеркамерно и терминально. Они шарообразны 10-12 мкм. Иногда отдельная клетка микроконидии образует хламидоспору.

Fusarium graminearum Schwabe 1М1 154211.

Меньше микроконидий, чем у 1М1 154209, меньше размером, проще, 1 перегородки, длиной 25-35 мкм. Образуется немного спородохии.

Обильные хламидоспоры, инеркалярно, отдельные и в цепочках. Fusarium graminearum Schwabe 1 Ml 154212.

Похож на IMl 154211, но имеет больше макроконидий, по количеству столько же, сколько у вида Ш1.154209.

Fusarium iJraminearum Schwabe 1 Ml 154213.

Макроконидий мало, имеются типа ciiopofloxi-in .вплоть до пачек хламидоспор. Много хламидоспор в мицелии. Макроконидии меньшего размера; чем у исходного, 30-35 4 мкм с 2 перегородками. , Fusarium grarrtnearum Schwabe Ш1 154210.

Похож на вид Ш1 154209, с обильными макроконидиями и хламидоспорами. Типичные макроконидии, 35-45 4 мкм.

Температуру инкубации поддерживают в пределах 25-34°С (предпочтительно 30° С), инокуляцию путем предварительной стадии проращивания 2-10% инокулята, обычно от 5-10%.

рН субстратной среды в процессе инкубации поддерживают в интервале 3,5-6,7, способствующем максимальному росту.

Период роста при серийном культивировании в указанных условиях составляет обычно 20- 48 час.

Как при периодическом, так и при непрерыв«ном культивировании следует проводить аэрирование и перемешивание, обеспечивающее достато1шое содержание растворенного кислорода и преодоление его дефицита, лимитирующего рост.

В субстратной среде должно быть достаточное количество основных питательных источников азота, серы, фосфора.

Для обеспечения максимальной скорости роста необходимо наличие витаминов, например биотина.

В субстратную среду добавляют нетоксичный противовспе1Шватель для регулирования пенообраэования в процессе ферментапди.

Образующийся мицелий отделяют путем промывки, фильтрации и сушки. При снижении содержания влаги до 50% путем фильтрации под давлением последующую сушку не проводят в строгом температурном режиме. Способ сушки не должен снижать питательную ценность мицелия, поэтому сушку ведут воздушной струей при 75°С или вьплораживанием (сублимацией).

Получаемый по предлагаемому способу грибковый мицелий связьшает воду и может использоваться в качестве сгустителя или желирующего средства.

Не будучи изолятом он сохраняет витамины и прочие питательные вещества, например липиды и некоторые углеводы.

Грибковый мицелий имеет .удовлетворительные свойства вьшекания и может быть использован в производстве обогащенного белком хлеба и закусок.

Благодаря волокнистой структуре грибковый мицелий можно печь, жарить, готовить иэ него сдобу и другие пищевые продукты по виду и приемлемости сравнимые с обычными пищевыми продуктами.

, Пример. Готовят 10 л кулыуральной среды и стерилизуют в ферментере при перемешивании состава

Мелассу (сахарный тростник) до

ь% вес. объем сахара

Сульфат аммония1 2% Na,H,PO,0,25% Стерилизуют 30 мин при 10,3411 Ю и/м, СаСОз0,5 вес.%/объем Стерилизуют 3 часа Компоненты среды вносят асептически и охлажденными до 30° С. Инокулум, эквивалентный 5-10 об.%культуралшой среды, выращенный на среде глюкозы (замочной жидкости кукурузы) или на другом соотвествующем материале в колбе-качалке, инокулируют суспензией спор организма, содержащей штамм Fusarium draminearuro Schwabe IMl 145425 Выращивают 18-24 час при 30° С во вращающейся качалке и вносят асептически в ферментер. Ферментер, инкубированный при 30°С; перемешивание при 800 об/мин с помощью турбинедисковой ме1шлки с 6 лопастями и отбойником, при аэращ1и через среду стерильного воздуха 1 об/мин. Через 35 час извлекают выросший мицелий, центрифугируют, промывают водой и сущат на ленточной сушилке горячим воздухом при 75° С. Высушенный продукт имеет следующий сосОбщий азот Зола Липиды 52 в пересчете на общий аз NPUop Пример 2. Готовят 10 л культуральной среды и стерилизуют в ферментере емкостью 14л (НЬЮ-Бунсвик, Микроферм). Данные о составе культуральной среды приведены в . Таблица 1. Указанную культуральную среду стерилизуют при нагревании 15 мин при 10,3411 10 н/м после чего в нее добавляют стерилизованные витамины или аминокислоты. Растворы вносят в ферментер асептически. Инокулум выращивают и вносят аналогично примеру 1, но конечную концентрацию в ферментере доводят до 0,5 г воздушносухого мицелия на 1 л. Условия выращивания: температура ЗО С аэрация 1 об/мин, скорость мешалки регулируют для поддержания в.культуральной среде растворенного кислорода на 25 % выше концентрации насыщения измеряемой npH6qpoM фирмы Нью-Брунсвик Инк. Стерильный противовспениватель - пропиленгликоль 2000 добавляют для подавления пенообразования, а рН поддерживают в интервале 6,0-6,3 добавлением стерильного раствора едкого калия. При выращивании культуры микроорганизмов без добавления стерилизованных витаминов или аминокислот скорость их роста очень медленная, а при добавлении последних с конечной концентрацией биотина 50 мкм/ л в культуральной среде скорость роста равна 0,2 час . При добавлении в культуральную среду стерилизованных витаминов или аминокислот с конечной концентрацией биотина 50 мкг/ л, хлорида холина 30 мг/ л и метионина 300 мг/ л скорость роста равна 0,25 час . П р и м е р 3. Приготовляют 100 л культуральной среды и стерилизуют в ферментере емкостью 130 л из нержавеющей стали. КомпонентыКонечная концентра1у1я, % Глюкоза4,0 Кутсурузная замочная жидкость (50% твердого вещества) Сульфат аммония KHl РО4 MQS04-7H2O ZnS047H2O FeSO47H2O MnS04- 4Н2О Среду стерилизуют 30 мин при рН 3,0 и 10,3411 н/м, затем охлаясдают до 30°, рН регулируют до 5,0 стерильной добавкой аммиака. Биотин стерилизуют фильтрацией, вносят асептически, обеспечивая конечную концентрацию 40 мкг/л, Ферментер инокулируют 10 л культуры, выращенной в резервуаре в течение 18 час при 30 на среде, содержащей, %: 2 глюкозы, 0,4 триптона (оксоид), 0,1 дрожжевого экстракта (оксоид) 0,15 сульфата аммония, 1 монокалийфосфата,0,1 едкого натра, 0,025 сернокислого магния, 0,001 сульфата двухвалентного железа, 0,001 сернокислого цинка, 0,0005 сульфата марганца, 0,001 -сульфата меди, 0,05 противовспенивателя-пропиленгликоля 2000, стерилизованной 45 мин при 10, 34110-10 н/м, инокулированной суспензией спор штамма Fusarium graminearum Швабе 1М1 145425. Условия выращивания: температура 30 , аэрацию регулируют в соответствии с необходамой концентрацией растворенного кислорода на 10% вьпце концентрации насьпцения в культуральной жидкости. Дпя подавления ценообразования добавляют полипропиленгликоль 2000, поддерживая рН около 5,0 путем добавления стерильного аммиака. Образцы мицелия после выращивания содерхат в пересчете на сухой вес: общий азот - 8,0-8,6%; азот альфааминокислот - 6,4-6,6%. Начальная скорость роста в комплексной среде, полученной из куцьту .ральной среды и инокулума, равна примерно 0,3 час

Ниже приводятся примеры 5 и 6, вьшолнения предлагаемого способа при непрерьшном культивироваш1и,

Пример 4. Готовят культуральную среду следующего состава:

конечная концентрация,%

T-aciuop 1

3,0

Глюкоза 0,25

Сульфат аммония Монокалийфосфат

илиКНаГО 0,3

Сульфат магния0,025

Полипропиленгликоль2000 0,01 г.терилизуют при рН 3,0 30 мин при 10, 3411 н/м . Раствор 2

MnSO44H2O0,0005

FeS04-7HiO0,0005

0,0005 0,0001 0,0001 0.0001

Сте рили зуют 15 мин. Раствор 3.

и/или аминокислоты стерилизуют фильтра1щей, как JTO описано ниже.

Все растворы вносят асептически.

Условия выращивания в хемостате емкостью 8,5 л следующие.

Температура 30° С, аэрация 1 об/мин, перемешивание при 800 об/ мин с помощью щестилопастной турбинно-дисковой мещалки в ферментере с отбойником.

В качестве микроорганизма используют штамм FusarJum qraminearum Schwabe IM 145425, рН 5,0 поддерживается автоматически добавкой стерильного аммиака.

Данные об условиях выращивания микроорганизма приведены в табл. 2.

Таблица2

Раствор 320 0,17-0,19 0,5 Раствор 3 20600 0,2-0,21 0,5

Пример 5. Готовят культуральную среду спстаая.%;

Крахмал бобовых (обраб.отан альфаамилазой)0,3 углеводов

Кукурузная замочная жидкость1,33

Сульфат аммония0,25

Монокалийфосфат0,15

П р и м е р 6. Культуральная среда и условия те же, что в примере 5.

рН вьщерживают на уровне 5,0 в течение всего процесса при 26-34° С. Оптимальная температура 30-32° С.

Пример 7. Дупликатные колбы-качалки елжостью 1 л заполняют 200 мл среды следующего состава, конечная концентрация,%:

Сульфат магния0,025

Полипропиленгликоль 2000 (объем/вес) 0,025 Стерилизуют 30 мин при 10,3411 10 н/м и рН 4,0.

Среду вносят в 8,5 л хемостат в условиях по примеру 4 при рН 3,5-6,0 и скорости роста 0,1

Данные об условиях выращивания микроорганизма приведены в табл.3,

Таблица 3

Раствор 1. Глюкоза (стерилизаци отдельно при рН 3,0 в течение 10 мин при 6,8941 ; 10 н/м) Раствор 2. Сульфат аммония МоН(жалийфосфат MgS0.7H20

FfeS04 (H4)2-0°6jH20

MnS04-4H2O 7,26,35465 7,7-8,6 6,1-6,3 .5978

0,0001

CuS04- 5H2O

СоСЬ-бН О 0,0001

0,0015

CaCl2-2H20 0,000001

Na2Mo04-2H20

0,2

NaOH

Стерилизацию проводят при 10,3411« 10 н/м в течение 15 мин при конечном рН 6,0.

Раствор 3. Витаминь стерштизуют фильтрацией. Растворы вносят асептически, обеспечивая конечный объем 200 мл, затем колбы инокулируют промытыми спорами штамма Fusarium graminearum Schwabe Ш1 154209 до концентрации 8- .

Условия роста, температура 30°, 140 об/мин на орбитальной качалке с дугой качания 508 мм-.

Через час интервалы измеряют рост путем определения оптической плотности образца при ,600 ммк.

При выращивании микроорганизма штамма Fusariumgraminearum Schwabe IMi 154209 на среде, не включающей раствора 3, скорость его роста очень медленная.

При включешш раствора 3 в среду и конечной концентрации биотина в ней 50 мкг/л скорость роста составляегО,22 .

При включении раствора 3 в среду и конечной концентрации биотина в ней 50 мкг/л и хлористого холина 50 мг/л скорость роста составляет 0,27 час .

При выраишванпн 1У1икроорганизмов штаммов Fusarium graminearum Schwabe IMl 154211, IMl 54212, IMl 154213, IMl 154210 и IMl 145425 на реде, описанной в примере 7, без включения расвора 3 стерилизованных фильтрацией витаминов корость их роста очень медленная.

ири вьфагцивании указанных штаммов на той е среде с включением в нее раствора 3 стерилизованных витаминов при конечной концентрации биотина в культуре 50 мгк/л, скорость роста равна 0,21-0,22 , а с добавлением биотена 50 мгк/л) и хлористого холина {50 мг/л)- 0,27 час.

изобретения

L Способ получения протеинсодержащего вещества путем вырахцивания грибов рода Fusarium в аэробных условиях в водной питательной средне, содержащей источник углерода в виде углевода, источник азота, минеральные соли и стимуляторы роста, с последующим выделением полученного продукта из культуральной жидкости, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повыщения качества полу-ченьюго продукта, из грибов poдaFusarium используют вид graminearum.

7.Способ по п п. 1-6, отличающийся тем что способ осуществляют при козффициенте разбавления среды предпочтительно равном 0,1 час .