Способ получения галактозооксидазы Советский патент 1981 года по МПК C12N9/04 

1

Изобретение относится к микробиологической промьСяленности, а именно к производству ферментных препаратов.

Галактозооксидаза используется в клинических и научно-исследовательс,ких биохимических лабораториях в качестве аналитического препарата для количественного определения галактозы в различных биологических материалах.

Известны способы получения близкого по механизму действия фермента глюкозооксидазы путем глубинного культивирования микроскопических гри-бов Aspergillus и Penicillium в присутствии гидрата сульфата магния, первичного кислого фосфата калия и источника азота-нитрата или аммониевой соли. Активность фермента в культурашьной жидкости 3-6 тыс. ед/л 1.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения га 1актозооксидазы, предусматривающий культивирование продуцирующего фермент микроорганизма на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и воду, глубинным методом в условиях аэрации с последующим выделением фермента.

Способ заключается в глубинном культивировании базидигшьного гриба Polyporus circinatus штс1ММ NRRL 2903, хранящегося в коллекциях США и Бразилии. Продуцент синтезирует внеклеточную галактозооксидазу на среде следующего состава, г/л водцл:

ГалактозаЮ

Фосфат калия однозамещен10ный9

Фосфат натрия двузамещенный 8

Сульфат аммония 2

Сульфат меди0,025

15

Сульфат марганца0,002

Сульфат магния0,2

Нитрат аммония1

Дрожжевой экстракт 1

рН среды 6,8-7,0.

20 Ферментация ведется при 25 С на качалке с 200 об/мин или в ферментерах, продолжительность выргицивания 72 96 ч. Галактозооксидазная активность культуральной жидкости 20 - 50 ед/мл 25 р.

Недостатком данного способа является применение в качестве продуцен,та гсшактозооксидазы труднодоступного для использования штамма NRRL -2903 базидиального гриба Polyporus

circinatus, нестабильность галактоэооксмдазной активности в культуральлой жидкости при глубинном выращивании продуцента на известной среде (после достижения максимума наблюда.ется резкое падение активности из-за Ьрисутствия в мицелии .гриба ингиби- тора неизвестной природы) и наличие примесей каталазы в препаратах Гсшактоз.ооксидазы, полученных известным способом.

Цель изобретения - получение целевого продукта без примеси каталазы, пероксидазы и галактозодегидрогеназы и улучшение таким образом качества продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения галактозооксидазы, предусматривающему культивирование.продуцирующего фермент микроорганизма на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и воду, глубинным методом вусловиях аэрации с последующим выделением фермента из культуральной жидкости, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм Fusari urn graminearum ИМВ - F № 1060.

Штамм Fuse ri urn gramirtearum ИМВ F № 1060 вьаделен в 1976 г. из корней пшеницы на территории Украины и имеет следующую характеристику:

Морфология. Культура Fusari urn graminearum ИМВ - F № 1060 образует субстратный, надсубстратный и воздушный разветвленный с поперчными перегородками мицелий. Толщина гиф субстратного и надсубстратного мицелия от 2,7 до 10,8 мк, воздушного 2,0 - 5,9 мк. Конидиеносцы обычно разветвленные в верхней части, на верхних спороносных клетках конидиеносцев (размер 13,5 - 27,0 х 2,7 3,2 мк) располагаются фиалиды по 24 в мутовке, размеры фиалид 10,8 13,5x2,7-3,О мк.

Конидии веретено-серповидные, суженные к обеим концам, располагаются на верхушках фиалид.пачками по 12-38 ШТ( и больше, образуя пионоты. Размеры конидий 45-86 х 3,5 - 5,4 мк

Культура Fusarium graminearum штамм ИМВ-F № 1060 быстро растетна сусло-агаре, агаре Сабуро, Чапека, Чапека-Докса, картофельном агаре, колонии на седьмые сутки достигают 90 мм в диаметре, высота 1-2-15 мм, рыхлые, войлочно-клочковатые.

Субстратный и надсубстратный мицелий винно-красный, карминный, воздушный мицелий розовый, светло-винно-красный, местами абрикосово-желтый. На обратной стороне колонии темно-красные.

Культуральные и биохимические свойства. На сусло-агаре, среде Чапека ДоКса, Сабуро,мальц-агаре, картофельном и картофельно-глюкозном

агаре к -льтура Fusariuin graminearuin штаглм ИМВ-F N 1060 растет хорошо, воздушный мицелий и спороносный слой обильный.

3 качестве единственного источника углерода предлагаемый штамм использует галактозу, глюкозу, маннозу, фруктозу, L - арабинозу, L - рамнозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, раффинозу. Усваивает нитратный и аммонийный азот, однако лучшим источником азота является мочевина. На известной полусинтетической среде при глубинном способе выращивания синтезирует внеклеточную галактозооксидазу. Активность культуральной жидкости на 72-ом часу выращивания 5-6 ед/ kn.

Для повышения активности культуральной жидкости штамм Fusarium grami nearum ИМВ-F № 1060 выращивают на среде следующего состава, г/л воды: . Галактоза 15-20 Фосфат калия

однозамещенный 7-9 Фосфат натрия двузамещенный 6-8 Сульфат магния 0,2 - 0,4 Сульфат меди О,025 - 0,05 Мочевина5-10

Дрожжевой экстракт.2-3

рН среды 6,8 - 7,0. Способ получения галактозооксидазы состоит из двух стадий.

Стадия 1. Выращивание вегетативйого инокулума.

Предлагаемую среду засевают маточной культурой Fusarium graminearum шт:аиал ИМВ-F 1060, выращенной на сусло-агаре. Выращивание инокулума производят на качалке с 200 220 об/мин 24-28 ч при .

Стадия 2. Биосинтез галактозооксидазы.

В колбы, содержащие среду того же состава, вносят 1-2%инокулума к объему среды. Ферментацию ведут на качалках с 200-220 об/мин при 28°С± 72-80 ч. Активность культуральной жидкости к .окончанию ферментации 15-25 ед/мл, в течение следующих 24-40 ч активность остается стабильной, а затем медленно снижается. Выделяют галактозооксидазу из культуральной жидкости известным способом.

П р.и м е р 1. Выращивание инокулума штамма Fusarium gram in ее rum ИМВ-F № 1060 производят в колбах емкостью 500 МП с 250 мл среды, содержащей, г/л воды:

Галактоза20,0

Фосфат калия однозамещенный9,0 Фосфат натрия двузамещенный 8,0 Сульфат магния 0,2 Сульфат меди 0,025 Мочевина5,0 Дрожжевой экстракт2,0 рН среды 6,8 - 7,0. Среду стерилизуют при 125с 30 ми Отдельно готовят и стерилизуют раст воры галактозы и сульфата меди, кото рые вносят стерильно в колбы перед посевом. Засевают колбы вегетативным мицелием культуры Fusari urn gram near urn штамм ИМВ-F 1060, выращенной в течение семи суток на сусло-агаре Выращивание инокулума ведут на качал ке с 200-220 об/мин 28 ч при 28с. Посевной материал в количестве 1% к объему среды вносят в ферментационны колбы емкостью 500 мл с 250 мл среды того же состава. Ферментацию ведут при 28®С на качалке с 220 об/мин 80 ч. Активность культуральной жидкости к концу ферментации 15 ед/мл. Активность галактозооксидазы измеряют пероксидазо-хромогенным мето дом. Принцип метода состоит в том, что образующаяся при ферментативном окислении галактозы перекись водоро да при участии пероксидазы окисляет хромогенный акцептор кислорода (одианизидин), оптическую плотность ко торого измеряют при длине волны 420 нм. За единицу активности фермен та принимают то его количество, кото рое вызывает изменение оптической плотности на одну единицу при длине волны 420 нм в 1-сантиметровых кюветах в течение 10 мин в условиях опы та. Выделение галактозооксидазы из культуральной жидкости осуществляют известным способом. При м е р 2. Выращивание ино кулума Fusariurn graminearum ИМВ-F № 1060 ведут на среде следующего сос тава, г/л воды: Галактоза20,0 Фосфат калия однозамещенный9,0 Фосфат натрия двузамещенный8,0 Сульфат магния О , 2 Сульфат меди 0,025 Мочевина10,0 Дрожжевой экстракт3,0 при рН среды 6,8 - 7,0 в условиях примера 1. Ферментацию проводят на среде того же состава в условиях при мера 1. Активность культуральной жидкости на 80 ч ферментации 25 ед/мл. Активность ферментного препарата стабильна в течение 1,5 лет при 4 С. Препарат может быть использован для разработки ферментативного метода определения ггшактозы. Полученный предложенным способом препарат галактозооксидазы обладает высокой специфичностью, катгшизируя окисление только галактозы, ее про- изводных, а также олиго- и полисеисаридов, в состав которых входит галактоза ( и р-метил-Д-гапактоэиды, Д-галактозамин, N - ацетилгалактозамин, галактозо-1-фосфат, УДФ-галактоэа, лактоза, раффиноза). Препарат галактозооксидазы-не -содержит примесей других ферментов - каталазы, пероксидазы, ггшактозодегидрогеназы, могущих влиять на скорость галактозооксидазной реакции. Формула изобретения Способ получения галгжтозооксидазы, предусматривающий культивирование продуцирующего фермент микроорганизма на питательной среде, содержащей источники углерода, .азота, минеральные соли и воду, глубинным методом в условиях аэрации с последующим выделением фермента из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью получения целевого продукта без примесей каталазы, пероксидазы и галактозодегидрогеназы и улучшения таким образом качества продукта, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм Fusari urn graminearum ИМВ-F 1060. Источники информащии, принятые во внимание при экспертизе 1.Патент США 3701715, кл. С 12 О 13/10, опублик. 1972. 2.C.Avigad, D.Amaral, C.Asensio, В ,L .Horec ke г . The d-galactose ox iase of Polyporus сireinatus . J .Biо 1 , them. 1962, 237, 9, 2736-2743 (прототип).