Штамм гриба FUSаRIUм охYSроRUм (SснLеснт)SNYDет HaNS для определения устойчивости сои к фузариозу Советский патент 1991 года по МПК C12N1/14 A01N63/04 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и представляет собой новый штамм гриба Fusarium oxysporum для получения инокулюма для искусственного заражения сои, используемого при селекции ее на устойчивость к фузариозу.

Цель изобретения - получение нового штамма, обладающего более высоким синтезом фузариевой кислоты и более высокой вирулентностью по отношению к сое.

Штамм получен из природных изолятов грибов Fusarium oxysporum, вызывающих фузариоз всходов, поражение стебля и увядание сои. Путем искусственного заражения изолированных корней сои устойчивой линии к-8409 и восприимчивого сорта Букурия по модифицированному методу отобран изолят F.oxysporum 690-10. который достоверно превышал остальные штаммы природных изолятов по патогенным свойствам.

Штамм идентифицирован по определителю В.И.Билай. Депонирован в коллекции Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии под № 35.

Штамм гриба Fusarium oxysporum (SchlextJSnydet Hans 690-10 имеет следующие культурально-морфологические и физи- ологобиохимическиепризнаки:

спорообразующий, макроконидии образуются в воздушном мицелии, веретиновидно серповидные, эллиптически изогнутые или почти прямые с постепенно и равномерно сужающейся неудлиненной верхней клеткой, с ясно выраженной ножкой или сосочком, с 3-5 перегородками, Длина макроконидий - 37,4±0,29 мкм, одноклеточ(

О 1ЧЭ

о о

ных микроконидий - 9,0± 0,04 мкм. Хлами- доспоры обильные промежуточные и верхушечные, шероховатые, неокрашенные. Образует круглые колонии с ровными краями с диаметром на пятый день при 24° С 76,03±0,61 мм, при 37-38° С 28,16±0,32 мм, при 7-8° С 14,2±0,34 мм. Мицелий воздушно-пушистый, фиолетово-лиловый.

Выращивание штамма осуществляют на указанных средах при 22-25° С.

Морфолого-культуральные признаки культур описывают на седьмой день, характер спороношения - на 15-й день.

При выращивании штамма на сусло-агаре колонии размером 7,0-7,5 см, круглые, невысокие, с ровными краями, нежно-пушистые, с возрастом уплотняющиеся и несколькосморщивающиеся, поверхность светло-фиолетово-лиловая, обратная сторона темно-лиловая, спо- рообразующий, макроконидии образуются а воздушном мицелии, веретеновидно-сер- повидные, эллиптически изогнутые или почти прямые с постепено и равномерно сужающейся неудлиненной верхней клеткой, с ясно выраженной ножкой или сосочком, с 3-5 перегородками. Длина чакришн идий 37,4±0,29 мкм, одноклеточных микроконидий 9,0±0,04 мкм, Хламидос- поры обильные промежуточные и верхушечные, шероховатые, неокрашенные.

На картофельно-декстрозном агаре колонии размером 6,0-6,5 см, круглые, невысокие, ровные, пушистые, с возрастом уплотняющиеся, бело-лиловые, обратная сторона темно-лиловая. Спорообразующий, макроконидии образуются в воздушном мицелии, веретеновидносерповидные, эллиптически изогнутые или почти прямые, с постоянно и равномерно сужающейся, неудлиненной верхней клеткой, с ясно выраженной ножкой или сосочками, с 3-5 перегородками. Длина макроконидий 35,5±0,23 мкм, одноклеточных микроконидий 8,7±0,02 мкм. Хламидоспоры обильные, промежуточные и верхушечные, шероховатые, неокрашенные.

На агаризованной среде Чапека колонии размером 5,0-6,5 см, круглые, невысокие, ровные, пушистые, с возрастом уплотняющиеся, белые, обратная сторона белая или желтоватая.

Спорообразующий, макроконидии отсутствуют, микроконидии обильные,эллипсоидальные, овальные и шаровидные, одно-, реже двухклеточные размером 5,0-9,0x3,5-5,0 мкм. Хламидоспоры обильные, промежуточные и верхушечные, шероховатые, неокрашенные.

Отношение к источникам углерода: усваивает сахарозу, глюкозу; отношение к ис- точнику азота: усваивает КМОз, NaNOa, казеин, соевый белок.

Температура роста: минимальная 4-6° С; максимальная 37,5° С; оптимальная 22-25° С.

0 Оптимальное значение рН среды при культивировании штамма на твердых питательных средах 6,2-6,4; на жидких средах 5,5. Растет на средах при значениях рН среды 1,4-8,0.

5Штамм не имеет маркерных признаков.

Штамм обладает способностью к биосинтезу фузариевой кислоты. Содержание ее в культуральной жидкости 14-дневной культуры 84,9 мкг/мл, что в 2 раза выше, чем 0 у известного штамма (50,8 мкг/мл).

При выделении фузариевой кислоты в чистом виде также выход приблизительно в 2 раза выше из штамма 690-10, чем из известного штамма.

5Штамм 690-10 хорошо растет на суслозгаре, картофельно-декстрозном агаре и на жидкой среде Чапека при поверхностном и глубинном культивировании. При выращивании глубинным способом мицелий и кони- 0 дни распределяются по всему объему среды. При стационарном выращивании образуется плотная белая пленка мицелия на поверхности. На твердых и жидких средах характер культур одинаков. 5Признаки штамма устойчивы. Штамм

хранят на сусло-агаре при 24° С под вазелиновым маслом 3-6 мес, затем пересевают. Получение препарата для инокуляции семян осуществляют выращиванием штам- 0 ма на сусло-агаре в течение 14 сут при 24-26° С, затем отделяют выращенную культуру от среды, измельчают на гомогенизаторе, разбавляют водой до титра спор 1x10 , вносят в стерильный песок из расчета 5 50 г суспензии культуры на 500 г песка. Песок увлажняют стерильной водой до 70-80% влажности. Полученный таким образом препарат используют для инокуляции - семян сои. 0

Перед инокуляцией семена стерилизуют поверхностно 96%-ным спиртом и розовым раствором КМпОз в тече ние 2 мин последовательно, затем промывают сте- 5 рильной водой и помещают в инфицированный культурой песок на глубину 2 см. Семена проращивают в течение 5 дн при 24-26° С s термостате без дополнительного освещения

Патогенность выделенных из природы изолятов представлена в табл.1.

Для дальнейшего повышения патоген- ности штамма проведена селекционная работа, которая включает следующие этапы:

1)моноспоровый рассев исходного изо- лята на стандартной твердой питательной среде сусло- агар (рН 6,2-6,4) при 24-26° С, в качестве ингибитора роста колоний в среду добавляют 20 мл/л бычьей желчи;

2)искусственное заражение 30 моноспоровыми клонами изолята 690 устойчивой к фузариозу линии сои к-8409 и восприимчивого районированного сорта Букурия, в результате чего отобран наиболее патогенный клон 690-10 (табл.2).

3)проверка стабильности агрессивных свойств моноспорового клона 690-10 при десятикратном пассаже через растения .устойчивой линии к-8409. Для этого искусственно заражают 100 семян сои внесением 10 г культуры гриба, полученной описанным способом при 24 ±1° С. Через 7 дн подсчитывают процент развития болезни по поражению проростков по стандартной шкале и из больных растений изолируют культуру возбудителя, этот прием повторяют десятикратно. Полученные результаты представлены в табл.3.

Моноспоровый анализ 10 генераций полученного штамма показал, что штамм не расщепляется по признаку патогенности.

Фитотоксическую активность (способность к биосинтезу фузариевой кислоты), как одну из составляющих патогенности, определяют в культуральной жидкости 14- дневной культуры исходного штамма и пол- ученного изолята 690-10. Грибы выращивают поверхностным способом в колбах на 500 мл (200 мл) при 24° С и рН 5,5 на жидкой среде Чапека. Содержание фузариевой кислоты в культуральной жидкости составляет для исходного штамма 40,8 и полученного штамма 84,9 мкг/мл (табл.3).

П р и м е р 1. Хранящуюся культуру штамма 690-410 рассеивают на твердую питательную среду сусло-агар (рН 6,2-6,4) и инкубируют в термостате при 24-26° С в течение 10 дн. Заражение осуществляют по модифицированному методу W.A.Kendall and K.T.Leath. Для этого из семян сои испытываемых сортов, поверхностно обеззараженных 98%-ным этиловым спиртом и затем водным раствором КМп04 в течение 2 мин, выращивают пятидневные растения в стерилизованном песке, увлажненном до 70-80% полной влагоемкости при 25° С без подсветки. Затем срезанные и промытые стерильной водой корни раскладывают в кюветы или чашки Петри с увлажненной

фильтровальной бумагой, на них помещают диски мицелия, которые вырезают сверлом с диаметром 1,5 см. По длине гниения корня при контакте с грибом на пятый день визу- 5 ально оценивают устойчивость сорта согласно разработанной шкале.

Так, сорт Букурия с длиной поражения корня 34,0 мм и Бельцкая-82 (33,0 мм) являются сильновосприимчивыми, сорт Скынтея

0 (15,0 мм) и Кишиневская-16 (16,0) - средне- восприимчивым, линия к-28409 (9,0 мм) - устойчивой.

В табл.4 дана шкала для определения устойчивости сортов сои при искусствен5 ном заражении штаммом 690-10.

Таким образом, используя штамм 690- 10 гриба F.Oxydosporum с высокой и стабильной патогенностью, можно охарактеризовать уровень фузариозоустой0 чивости сорта по величине пораженного участка корня: чем выше данный показатель, тем ниже устойчивость.

П р и м е р 2. Определение фитотоксиче- ской активности.

5Штаммы (690 и 690-10) выращивают в

стационарных условиях при 28-30° С в течение 14 дн на жидкой среде Чапека следующего состава, г: KNOa 2; КН2Р04 1; MgSCV 7Н20 0,5; KCI 0,5; FeSOi 7H20 0,01; сахаро0 за 30; вода 1 л; рН 5,0-5,5.

По 10 мл питательной среды разливают в пробирки, засевают культурой штаммов и выращивают методом поверхностного куль- тувирования. Полученную культуральную

5 жидкость отделяют от мицелия центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об/мин и доводят до рН 7 добавлением 1н. раствора КОН. Содержание фузариевой кислоты определяют в полученном нейтральном рас0 творе спектрофотометрическим методом, сравнивая интенсивности поглощения света подкисленным подщелочным растворами культуральной жидкости. Для этого к пробе 4 мл нейтрального раствора добавляют 1 мл

5 1н. HCI04. Максимальное различие коэффициентов поглощения кислого и щелочного растворов обнаруживают при длине волны 274 мкм. Содержание фузариевой кислоты вычисляют по формуле:

0

С мкг/мл 39,3 А Е х 274, где Е - разница экстинций подкисленного и подщелочного растворов, содержащих фу- зариевую кислоту.

5 Содержание фузариевой кислоты в культуральной жидкости штамма 690 составляет 40,8 мкг/мл, у штамма 690-10 - 84,9 мкг/мл.

П р и м е р 3. Выделение фузариевой кислоты.

Штамм 690-10 выращивают, как описано в примере 2. Культуральную жидкость отделяют от мицелия фильтрованием через бумажные фильтры, подкисляют до рН 4,0 2 н. раствором HCI, тщательно взбалтывают с этилацетатом, взятом в соотношении 1:5. Смесь отстаивают, отделяют этилацетат в делительной воронке и испаряют. Полученный осадок растворяют в небольшом количестве воды, подщелачивают NaHCOs до рН 8-8,5. Препарат очищают, встряхивая дважды с половинным объемом эфира. Затем культуральную жидкость отделяют, снова подкисляют до рН 4,0, добавляют эфир в 5-кратном объеме и снова взбалтывают. Эфир сливают с испарительные чашки. После испарения эфира образуется экстракт, содержащий фузариевую кислоту.

Эффективность штамма 690-10.

Штамм 690-10 по патогенности превышает штамм 690 в 2 раза (интенсивность развития болезни по корневым гнилям 94,4 и 38,4%, по поражению семядолей 58,4 и

30,1 %, соответственно для исходного и полученного), а также достоверно превышает все исследованные природные изоляты. Уровень содержания фузариевой кислоты в культуральной жидкости штамма 690- 10 составляет 84,9 мкг/мл, что в 2 раза выше, чем у исходного (40,8 мкг/мл). Штамм 690-10 может быть использован в качестве продуцента фузариевой кислоты, необходимой для проведения экспериментальных исследований с токсинами грибов.

Использование штаммов, в частности 690-10, обладающего высокой и стабильной патогенностью, дает возможность достоверной оценки уровня фузариозоустойчиво- сти сортов при применении лабораторного метода искусственного заражения для ускорения селекционного процесса.

Формула изобретения

Штамм гриба Fusarlum oxysporum (Schlecht) srvyd et Hans ВНИИСХМ № 35 для определения устойчивости сои к фузариозу.

Таблица 1

Изобретение относится к сельскому хозяйству и представляет собой новый штамм гриба FUSARIUM OXYSPORUM для получения инокулюма для искусственного заражения сои, используемого при селекции ее на устойчивость к фузариозу. Целью изобретения является получение нового штамма, обладающего более высоким синтезом фузариевой кислоты и более высокой вирулентностью по отношению к сое. Штамм выделен из природных изометов грибов FUSARIUM OXYSPORUM, вызывающих фузариоз всходов, поражение стебля и увядание сои. Штамм гриба FUSARIUM OXYSPORUM (SCHLECHT) SNYD ET HANS 690 - 10 депонирован в коллекции ВНИИСХМ под N 35. Синтез фузариевой кислоты на 14 сутки на среде Чапека составляет 84,9 мкг/мл, а у природного - 40,8 мкг/мм, вызывает поражение корня сои сорта Букурия - 34 мм, сорта к - 8409 - 9,0 мм. 4 табл.

.,

Устойчивая линия.

Восприимчивый сорт.

Таблица 2

Та б л и ц а 3

Таблица 4