Способ получения лизосомального полиферментного препарата для лечения инфицированнных очагов Советский патент 1977 года по МПК A61K38/46 

роваиных очагов поясняется следующим примером,

П р и м е р. 1 кг свежеполучечЕЮй печени крупного рогатого скога промывают в охлажденном физиологическом растворе, измельчают путем продавливания через перфорированную пластину из нержавеющей стали (пресс с диаметром отверстий около 1 мм) и гомогенизируют в цилиндрическом- гладкое- тенном стеклянном гомогенизаторе с фторопластовым пестиком (зазор 0,21 - 0,23 мм нри 15OU об/мин в течение 120 сек. В качестве суспендирующей среды используют изотонический 0,25 М раствор сахарозы с О,ОО1 М ЭДТА (рН 7,4). Разведение ткани 1:9.

Гомогеват фильтруют через нейлоновый фильтр и оставшиеся на фильтре неразрушенные компоненты ткани регомогенизируют в том же объеме среды. Осаждение субклеточных структур осуществляют с помощью дифференциального центрифугирования, используя для этого угловые роторы большого объема или роторы непрерывного действия. Объединенный фильтрат центрифугируют при 350О в течение 10 мин. Осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость вновь цен- три зугируют в течение ЗО мин при ЮОООА для выделения лизосом. Полученный осадок (лизосомы) ресуспендируют в 9 л среды и повторно центрифугируют при этих же условиях. Дополнительное обогащение фракции лизосом и ее очистку осуществляют с помощью центрифугирования суспензии лизосом в градиенте плотности среды (сахарозы,

фиколла) в роторах с поднимающимися пробирками или роторах зонального типа. Для очистки лизосом от низкомолекулярных соединений плотный осадок осторожно заливают охлажденным физиологическим раствором и промывную жидкость быстро удаляют. Эту процедуру повторяют, используя в качестве промывной жидкости бидистиллированную воду. Дополнительную очистку осуществляют путем диализа ресуспендированного осадка против воды. Для получения лизосом с различной степенью повреждения мембран полученный осадок тщательно ресуспендируют в 1 л физиологического раствора, после чего подвергают поэтапному замораживанию (при -2ОС) и оттаиванию (при +2О°С). В зависимости от Кол1гчества повторений этой обработки достигается различная степень повреждения (Раскрытия) лизосомальных мембран. Для получения лизосом с полность разрушенной мембраной полученный осадок ресуспендируют в 1 л бидистиллированной .воды и замораживают при -20. Процедуру замораживания и оттаивания повторяют не менее 8-1О раз, после чего суспензию

сразу же подвергают лиофилизации. Для получения высокорастворимой разновидности лизосомального полиферментного препарата суспензию лизосом с полностью разрушенной мембраной предварительно центрифугируют при lOOOOOgB течение ЗО мин для осаждения мембран и лиофилизации подвергают надосадочную жидкость, содержащую растворимые ферменты матрикса лизосом. Для увеличения выхода препарата осадок, содержащий лизосомальные мембраны, вновь ресуспендируют в бидистиллированной воде и лиофилизируют. Высокорастворимую разновидность лизосомального полиферментного препарата перед лиофилизацией подвергают стерилизации путем фильтрации через ультрамикропористые мембранные фильтры. Для получения разновидностей лиаосомального пачиферментного препарата в суспензию или раствор перед лиофилизацией добавляют расчетное количество необходимого дополнительного химиотерапевтического средства (антибиотики, сульфаниламидные препараты и др.). Полученный после лиофилизации порощок расфасовывают в стерильные стеклянные флаконы и закупоривают. Выход препарата составляет около 2О г (в расчете на сухой вес); высокорастворимой разновидности препарата - около 3г.

Хранить полученный лизосомальный полиферментный препарат и его разновидности необходимо в лиофилизированном состоянии в герметических стеклянных флаконах при температуре -4 - -8 С. При хранении в этих условиях активность препарата практически не изменяется в течение 8-1О месяцев.

С целью увеличения содержания лизосом в исходном материале вызывают индукцию их образования и биосинтеза лизосомаль 1ых ферментов путем предварительного воздействия на животнькс с помощью различных элементарных факторов (голодание, содержание на малобелковом рационе и др.).

Лизосомальный полиферментный препарат может быть использован в клинике- для энзиматической обработки инфицированных огов в целях расплавления некротизированных структур различных тканей и их очищения. Полиферментный препарат и его ризновидности могут быть применены при лечении гнойных ран и ожогов, хронических незаживающих язв; при лечении травматичсчжих и послеоперационных гематом, остеомиелитов, абсцессов; при пневмококковых и туберкулезных менингитах (путем внутрилюмбального введения высокорастворимо разновидности препарата); при различных заболеваниях дыхательных путей-бронхитах, бронхоэктазах, абсцессах легких, трудно1з)3решаюшихся пневмониях и ателектазах, хронической бронхиальной астме и эмфиземе; в стоматологии - при лечении гангре корня зуба, при воспалении десиевых карманов, парадонтозах; в офтальмологии - при чечении коньюнктивитов; в отоларингологии- при лечении воспалительных заболеваний носоглотки и среднего уха; в дерматологии, гинекрлогиии других областях медицины.

Преимуществом лизосомального полиферментного препарата является то, что в состав его входят все ферменты, неоьходимые для полной деградации любого из известных биополимеров, причем эти ферменты устойчивы по отношению друг к другу.

Формула изобретения

Применение способа выделения лизосом, включающего гомогенизацию биологического материала, осаждение субклеточных структур, выделение и очистку фракции лизосом для получения Л113осомального полифермснт- ного препарата для лечения инфицированных очагов.

Источники информации, принятые во внимание ii|jiT экспертизе:

1, Патент США № 3409719, кл. 42-194, 1968.