Способ определения активности биопрепаратов Советский патент 1980 года по МПК G01N33/16 

(54) СПОСОБ -ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ БИОПРЕПАРАТОВ

неиные недостаточные фракции центрифугируют в течение 1 ч при 105000 в центрифуге АС-601. .Супернатаит осторожно отбирают пастеровской пипеткой (фракция цитозоля). Все описанные операции проводят на холоду (не выше 4°С).

В гомогенатах и субклеточных фракциях определяют свободную и общую активности гликозидаз Общую активность ферментов исследуют после полного разрушения субклеточных структур путем добавления в инкубационную среду доторгента-тритон-х-10 Принцип метода определения активности лиэосомальных гликозидаэ основан на спектрофотометрич.еском исследовании количества образовавшегося продукта ферментативной реакции.

Активность р-галактозидазы и р-глю1 озидазы определяют по методу in vivo и in vitro в качестве субстрата для определения р-галактозйдазы используют |Ь-нитрофенил- -Д-галактопиранозид, а для р-глю5 козидазы - р -нитрофенил-Д-глюкопиранозид. Активность гиалуренидазы 6пределяют по методу Dislie . В качестве субстрата используют калиевую соль гиалуреновой кислоты. Активность ферментов выражают в микро1 элях расщепленного субстрата за 1 мин на 1 г белка. Количество белка определяют по методу Uovi/rS. В таблице приведены результаты опреS деления активности гликозидаз в гомогенатах и субклеточных фракциях в норме и при воздействии на ткани глаза семикаобозиаом.

Для оценки результатов исследования, например в цилиарном теле, подсчитывают процент отношения свободной активности -глюкозидазы к общей в митохондриальной фракции, содержащей большую часть лизосом (по данным проведенной нами электронной микроскопии для.контроля за чистотой фракции) также подсчитывают процент активности фермента в цитазоле от активности в гомогенате. В норме отношение свободной активности к общей составило 40,6%, а после, действия семикарбозида - 66,7%; процент выхода фермента в цитозель составлял в норме 6,7%, а после действия препарата увеличился до 9% (статистически достоверно).

Следовательно, семикарбозид вызывает увеличение процента свободной активности от общей мембраносвязанной (Ь-глюкозиданы в митохондриальной фракции и повышение выхода лизосомальных ферментов в цитозоль. .

Эти данные свидетельствуют о. том, что семикарбозид уменьшает прочность связи (Ь-глюкозидазы с мембраной, т. е. лабилизирует мембрны лизосом цилиарного тела.Лабилизация лизосомальных мембран способствует выходу ферментов из лизосом и увеличению фермент-субстратного взаимодействия, что может привести к усилению распада мукополисахаридов ткани.

Однозначность результатов опытов с семикарбозидом in vivo и in свидетельствует р том, что этот препарат действует непосредственно на мембраны лизосом, без промежуточных звеньев.

Предлагаемый способ обеспечивает возможность получения сведений о механизме действия веществ на мембраны лизосом, высокую точность определения, а также позволяет подбор

0 оптимальной дозировки и обоснования применения того или иного препарата.

Формула изобретения

5

1.Способ определения активности биопрепаратов при действии на лизосомальную мембрану путем испытания их лп xivo и - nvitro /отличающийся тем, что, с

0 целью повьлиения точности способа, испытуемый препарат вводят с дезоксикортикостероном, определяют активность лизосомальных ферментов различных тканей и по изменению .

5 уровней этих ферментов определяют активность биопрепаратов.

2.Способ по п. 1, отли.ча ющ и и с я тем, что дезоксикортикостерон берут в концентрации 50

15 мг/кг.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Вопросы медицинской химии., т. XXI, вып. 3, с. 307, 1975.