Способ получения орготеина Советский патент 1977 года по МПК A61K37/04 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГОТЕИНА

применением эритроцитов, не содержаших сыворотки, но предпочтительным исходным материалом является цельная кровь.

Цельную кровь и особенно эритроциты, не со держащие сьшоротки, смешивают с водой (например, 1-2 об.ч.) перед нагреванием. Вода может содержать буфер или ионы двухвалентного металла, например меди или цинка, при небольших концентрациях, например, ниже 0,5 М. При использовании цельной крови добавляют тринатрийцитрат или другой ингибитор свертьшания для предотвращения свертьшаийя крови перед лизисом гемоглобина.

. Значение рН при иагреваш и равно 7. При более низких значениях рН, например ниже 5, гемоглобин денатурируется, осаждается лишь частично. Значение рН эритроцитов регулируют добавлением подходящего ко.пичества кислоты или основания.

Стадию нагревания ведут при температуре 60-80°С, предпочтительно 70-75° С, до осаждения всего или почти всего гемоглобина. Повышение температуры и более длительное нагревание способствуют снижению общего выхода орготеина. Более низкая температура и короткое нагревание приводят к получению менее чистого орготеина. При 75°С нагревание ведут 1-2ч. Стадию нагревания можно осуществлять периодически или непрерьтно.

Термолабильные белки, в том числе фермеиты, уда.ш1ют из эритроцитов путем термоденатурации вместе с гемоглобином. Основным компонентом таких термолабильных белков является карбоангидраза. Эритроциты нагревают до инактивирования карбоангидразы.

При осаждении гемоглобина карбоангидраза и большинство других термолабильных ферментов и белков неферментного происхождения в верхнем слое жидкости также осаждаются, ввиду того, что гемоглобин более стоек.

Полноту осаждения гемоглобина устанавливают по окрашиванию верхнего слоя жидкости, которая .становится бледно-розовой.

При использовании старой крови возможны случаи, когда все окрашенные вещества гемоглоби на могут не осадиться, если стадию нагревания осуществляют в кислой среде. Если это происходит перед или после удаления гемоглобина, осажденного на стадии нагревания, то любые остаточные скрещивающие вещества можно осадить доведением значения рН до 7 или до 7,5 перед осажде1шем орготеина. Осажденные вещества красного цвета удаляют таким же образом, как при осаждении гемоглобина на стадии нагревания. После нагревания эритродать охлавдают до температуры ниже 50° С, предпочтительно до комнатной температуры, пропусканием через теплообменник. Гемоглобин и .другие белки, осажденные на стадии нагревания, удаляют центрифугированием и отбрасывают (можно также использовать отстаивание или фильтро. вание).

После удаления осажденного гемоглобина выделяют орготеин из верхнего слоя жидкости, например, добавлением ацетона к охлажденному раствору, яиофилизацией, ультрафильтрованием или же адсорбцией на колонке с ионообменной смолой с последующим элюированием. Предпочтительнее всего выделять орготеин ионообменной хроматографией.

Вьщелять орготеин можно пропусканием верхнего слоя жидкости, по.Г1ученного на стадии нагревания, через ДЭАЭ-целлюлозу. Верхний слой жидкости можно также подвергать очистке с использованием молекулярноситовой хроматографии, например, пропусканием через колонку, заполненную декстрановой смолой, сшитой эпихлоргидрином.

Неочищенный .орготеин, содержащийся в верхнем слое жидкости, подвергают очистке путем избирательного выпаривания инородных белков, предпочтительно с протеиназой. Strep, griseus с

панкреатином, субтилизином, попашюм или бромелиаином при весовом соотношении фермента и белков в верхнем слое жидкости примерно от 1:2 до 1:1000, в зависимости от выбранного фермента и соотношения инородных белков и орготеина в

смеси. Чистый орготеин вьщеляют из смеси, например, ультрафильтрованием. Остатки белков и избыток ионов удаляют из варочной смеси диализом перед вьщелением из этой смеси орготеина.

После удаления осажденных посторонних белков орготеин осаждают остаточным количеством ацетона - от 3/4 до 1,5 об.ч. в расчете на водный раствор.

Предварительное осаждение посторонних белков и орготеина проводят на холоду, например при

О-5° С, но можно его прюводить и при комнатной температуре до точки кипения ацетона. Осаждегшый орготеин отделяют от остаточного количества растворите.ш и влаги, например, сушкой, вымораживанием или лиофилизацией или же повторным растворением в водном связующем для последующей очистки во избежание потерь орготеина.

Пример. Промытые эритроадты быков лизируют двукратным объемом воды, содержащей 1 мг двухвалентной меди и 1 мг двухвалентного

цинка на 5 мг орготеина, находящегося в эритроцитах, и нагревают до 70-75°С в течение 1-2ч при З51ачении , т.е. при изоэлектрической точке гемоглобина. Разбавляют в 2-3 раза, охлаждают и центрифугируют полученный шлам при температуре

4С. Верхний слой жидкости, полученный после центрифугирова}шя и содержащий в значительной степени очищенный орготеин, подвергают диализу и лиофилизируют. Выход орготеина 70%.

Пример 2. Суспендируют промытые консервироващые эритроциты, замороженные и не содержащие сьшоротки, в двойном (по объему) количестве воды. Подкисляют до рН 5,5 уксусной кислотой. Суспензию нагревают 15 мин при 65° С. Полученную жидкость охлаждают до температуры окружаюшей среды (лли более 1шзкой температуры)

И удаляют осажденные бедки центрифугированием. Доводят рН до 7,5 с целью осаждения веществ, окрашенных в красный цвет, и центрифугируют. Верхний слой жидкости после центрифугирования сменшрают с 3/4 объема ацетоиа, охлажденного льдом, центрифугируют и осадок отбрасывают. Добавляют вторую порцию 3/4 объема холодного ацетона, центрифугируют и отделяют осадок, содержащий 50% орготеииа. Для сохранения неочищенного орготеина осадок подвергают сушке вымораживанием, а затем его лиофилизируют.

П р и м е р 3, Используют эритроциты человека, быков, лощадей, кур, овец или свиней. Методика аналогична примеру 2, но осаждение ацетоном заменяют на ферментативное переваривание бе/псовых примесей, например, добавлением к верхнему слою жидкости после стадии нагревания 1-Змг панкреатина на 1 мл исходных консервированных эритроцитов и вьщерживания смеси при 37° С в тече1ше 15-48 ч. В результате происходит переваривание почти всех белков, за исключением орготеина, на небольшие диализуемые фрагменты. Из полученной смеси путе м ультрафильтрования выде11яют в значительной степени очищенный орготеин.

П р и м е р 4. Следуют методике, описанной в примере 1, но в качестве исходного материала применяют цельную кровь, стабилизированную против коагуляции цитратом натрия. Смешивают 2 об.ч. свежей бычьей крови (85 мг/мл общего белка, 20 мг/мл орготеина) и 1 об.ч. 3,8%-ного водного раствора тринатрийцитрата с 2 об.ч. воды, содержа; щей 25 мг/мл двухвалентной меди и 25 мг/мл двухвалентного цинка. Получают раствор цельпой крови, содержащей 1000мг ионов двухвалентной меди и двухвалентного цинка на 100 мл. Раствор нагревают до 7 5° С и выдерживают при этой температуре 2 ч. Затем охлаждают до 10° С добавлением 150 мл ледяной воды. Это разбавление устраняет необходимость отдельной стадии промывки после центрифугирования. Центрифугируют и отделяют верхний слой жидкости, содержащий 1,6 мг/мл белка и 12-17 мг/мл орготеина, что представляет собой 40-кратную очистку и извлечение 70% орготеина исходной крови. При использовании непромытых эритроцитов (90 мг/мл общего белка) вместо цельной крови извлекают 9О/Ь орготеина. Очищенный орготеин въщеляют из верхнего слоя жидкости лиофилизацней, или фильтрованием через молекулярное сито, или хроматографией с применением ДЭАЭ-целлюлозы.

Для последующей очистки орготеина смешивают 50 мл верхнего слоя жидаости после стадии термической очистки, содержащей 12-17 мг/мл

орготеина, с 50-150мг панкреатина и 0,1% азида натрия (для предотвращения роста бактерий) и выдерживают при температуре 37° С в течение 15ч, после чего охлаждают. Получают раствор, содержащий 1 мг/мл общего белка и 12 мг/мл орготеина.

Неочищенный орготеин можно выделить в чистом состоянии путем хроматографии через гЬть из молекулярного сита пропусканием 2-5 г неочищенного орготеина через колонку размером 3,2 см 38,5 см, заполненную сверхтонким Сефадексом G-75, представляющим собой декстряковую смолу, сиштую зпихлоргидрином. Собирают элюат на фракции по 5,4 мл и определяют их поглощение. Начиная примерно с 50-ой фракции, кривая поглощения круто пошшмается, достигая

пика примерно на 68-ой фракции. Фракции 66-73 содержат большую часть всего орготеина в ультрашстом состоянии.

Формула изобретения

Способ получения орготеина путем лизирования эритроцитов, осаждения, прогревания гемоглобина и других термолабильных белков, охлаждения, очистки и выделения целевого продукта из верхнего слоя жидкости, отличающийся тем, что, с целью упрощения технологии производства, гемоглобин осаждают путем, нагревания эритроцитов при температуре 60-80° С при рН раствора от 6,7 до 7,5.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент США №3579495, кл. 260-115, I97k