Способ выделения орготеина Советский патент 1976 года по МПК A61K38/17 A61K35/12 A61K38/22 

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ОРГОТЕИНА

мер, ацетона, метанола, этанола, буферный раствор с ионной силой, например 0,01-0,05М, предпочггительно 0,02-0,ОЗМ. Выделение рекомендуют вести при слаЦ бо щелочной величине рН, находящейся в пределах между 7 и 9, предпочтительно между 7,5 и 7,8.

Для повышения ионной; силы экстраген- та в него вводят хлористый калий, хлор стый натрий, сульфат двухвалентного марганца или другие незабуферивающие соли.

Для повышения избирательности буфернго раствора в него добавляют растворимы сахариды, например глюкозу, сахарозу и . т.д., что облегчает процесс экстракции.

Смесь суспендированных частиц тkaни и водного экстракта разделяют путем фильрования под давлением или в вакууме, или путем центрифугирования.

Для осуществления способа пригодны растворимые белки красных кровяных клеток, содержащие орготеин и имеющие изоэлектрическую точку, отличающуюся от изоэлектрической точки ангидразы угольной кислоты, присутствующей в смеси, по меньщей мере, на одну единицу рН. Предпочтительны растворимые белки красных кровяшых клеток быков, цыплят и человека.

Красные кровяные клетки отделяют от плазмы крови путем центрифугирования, выделенные клетки промывают и повторяют центрифугирование, удаляя остаточную плазму.

Обработанные таким образом клетки подвергают лизису (разрущению клеток) под действием ультразвука.

После удаления нерастворимых компонентов клеток, на долю которых приходит с я около 2 % по весу консервированных клеток, раствор растворимых белков из подвергшихся лизису красных кровяных клеток контактируют с хроматографичес- КИМ адсорбентом, для того чтобы произошла адсорбция орготеина. (

Для того чтобы уменьщить влияние растворенных солей на способность орго- теина к адсорбированию на хроматографи- ческом адсорбенте, рекомендуют поддерживать ионную силу исходного раствора, на уровне от 0,ОО1 до 0,005М.

По предлагаемому способу в качестве адсорбентов используют диэтиламиноэтил- целлюлозу (ДЭАЭ), триэтиламиноэтил-ц&ллюлозу (ТЭАЭ), диэтиламиноэтил-сефа- деке и QAE-сефадекс. Такие смолы име- ют адсорбционную емкость, составляющую примерно от 1,0 до 5 миллиэквивалента на грамм.

Орготеин выдел5пот из ионообменивающей смолы методом избирательоного элю-i

чрования.

Сначала вымывают из колонки весь гемоглобин и другие не подвергшиеся адсорбции белки, а затем осуществляют избирательное элюирование ор1 отеина из колонки и выделение его из той фракщш элюата, которая содержит чистый орготёи.

Удаление гемоглобина, миоглобина и других не адсорбировавшихся белков осуществляют путем промывания -колонки водным элюентом, величина рН которого составляет примерно 6, или же фосфатным буферным раствором.

После удаления из колонки гемоглобина и других, не подвергщихся. адсорбции, белков, проводят избирательное элюирование орготеина из колонки при помощи водного

элюента, величина рН которого составляет примерно 6, например находится в пределах между 5,7 и 6,3 и с таким варьированием ионной силы, чтобы элюирование адсорбировавшихся белков происходило после-

довательно. Для этого используют буферный раствор с ионной силой около О,001-0,005М для элюирования легко элюирующихся белковых смесей, примерно 0,02-0,ОЗМ для элюирования орготеина и примерно 0,1 - ,2,ОМ для освобождения колонки от остаточf1ых белковых примесей.

IHi

Определение фракшш элюата, содержащей чистый орготеин, осуществляют путем измерения оптической плотности элюата при

длине волны 28О ммк и 265 ммк. ...

Начало отбора фракции элюата, содержащей существенные количества меди и щшка считают началом отбора фракции орготеина, если в качестве исходного материала применяют растворимые белки тканей животных.

Окончание отбора фракции орготеина оп- ределяют по резкому снижению содержания меди и цинка и по резкому повышению оп-. |тической плотности при длине волны 265 или 280 ммк.

Чистый орготеин может быть подучен термической обработкой предварительно очищенного на ДЭАЭ-целлюлозе орготеина.

Орготеин экстра-чистоты получают из выделенного на ДЭАЭ целлюлозе орготеина путем последующей термической обработки части элюата, содержащего орготеин, ионы

двухвалентной меди и ионы двухвалентного цинка, например, при температуре 65-75°С в течение 15 мин, при величине рН 5,8 с последующим центрифугированием и диализом, путем повторной ионообменивающё,

{хроматографической очистки на ДЭАЭ-целлюлоэе нли путем обработки протеопитичео КИМ энзимом, i Пример 1, Орготенн из печени бы ка. Печень быка (212г) иарезают на поло ки шириной 2 см, удаляют соединительную ткань и кровеносные сосуды, промывают для удаления крови и гомогенизируют при максимальной скорости в быстроходном см сителе, используя на 1 кг печени 3,8 мл трис-глициноБого с ней буферного раство ра с рН 7, 5,ОЗМ по сахарозе и О,05М по НС8 , Затем центрифуги)уют при О С 60 мин. Центрифугат отделяют, производят диализ верхнего слоя жидкости с использо ванием фосфатного (0,005М) буферного раствора с величиной рН, равной 6,0, Зате снова центрифугируют и фильтруют через микропористый фильтр (версанор) для по лучения прозрачного раствора. Фильтрат вносят непосредственно в ионо о менивающую колонку диэтила1 1иноэтил-це люлозы (около 4Ог, 2,5 см х 40 см). Ко лонку промывают (скорость течения 200 мл/час)- при помощи 1 л фосфатного буфер ного рэаствора (0,О05М, рН 6,0) и затем четырьмя литрами того же буферного раствора, содержащего хлористый натрий в количестве ПОСТО5ШНО и постепенно во,эраста ющем в интервале от О до 7,5х1О М, при скорости течения 200 мл/час. При этом производят непрерывное измерение оптической плотности А,,, и Арпд элюата и постоянный контроль содержания меди и шшка с использованием метода адсорбционной спектрофотометрии. После отбора 1 л элюата, не содержащего хлористый натрий, собирают 750 мл элюата, содержащего постепенно возрастающие количества хлористого натрия или хлористого калия, в этот момент времени молярность постепенно достигает величины 0,О18М, величины оптической плотности Аре- и уменьшаются до низких величин, а содержание меди и цинка резко возрастает. После этого собирают элюат и отбор его ведут до тех пор, пока содержание меди снова снизится до мршимально- го, а молярность достигает величины около 2,8x10 М (55О мл элюата,который содержит 240 мг орготеина высокой степени чистоты). Чем меньше фракция, отбираемая из этой порции элюата, тем больше степень чистоты присутствующего в ней и выделяемого из него орготеина и тем меньще его выход. Орготеин наивысшей степени чистоты присутствует в элюате, ионная сила которого составляет примерно 0,022А (при общем объеме элюата 950 мл). В этой точке кривые поглощения меди и цинка имо« ют максимумы. Диализ фракции, находящейся в штер& ле объема отбираемого элюата от 750 до 1300 мл, производимый с использованием воды до снижения проводимости до 0,04М, (фильтрование через микропористый фильтр (и лиофилизация проводимая в стерильных условиях, предпочтительно после, смешения, примерно вдвое большим весовым количеством сахарозы (из расчета на орготекн), приводят к получению вьщйле шого полностью активного, неантигенного, пригодного для инъекций орготеина, качество которого сравнимо с качеством того же препарата, изготавливаемого е лромышленности для исполь зовання в ветеринарии. Промывание колонки для удаления не адсорбированных или слабо адсорбированных белков до элюирования орготеина осуществляют при постоянной ионной силе, со ступенчатым повыщением ионной силы или при непрерывном повышении ионной силы, например путем элюирования колонки буферным раствором с ионной силой, на эдящимся в интервале между, примерно, О,012М и, мерно, 0,015М, производимым до тех пор, пока величины оптической плотности Аг 265 не снизятся до минимальных значений, с последующим элюированием орготеина при постоянной величине ионной силы, при ступенчатом повышении ионной силы, или при непрерывном повышении ионной силы в пределах между, примерно, 0,О18М и, примерно, О,028М. Затем колонку освобождают от остаточных адсорбированных белков путем повышения ионной силы элюента до величины около 0,1М или выше. При применении способа, описанного в примере 1, сходные результаты были получены при использовании в качестве адсорбентов ТЭАЭ-целлюлозы и имеющей попе речные связи декстрановой смолы, содержащей .диэтиламиноэтильные группы, При применении способа, описшшого в примере 1, сходные результаты получены, когда в качестве исходного матер1{ала при-: меняют растворимые белки, выделен1 ые соответственно, из тканей бычьего мозга, почек, селезенки, легких, семенников, подж&лудочной железы, тимуса, мышц и тех же тканей свш1ей, лошадей, овец и цыплят. Пример 2. Орготеин из крови. Свежую бычью кровь (87О мл) собирают в 3,8)о-ном растворе цитрата натрия (0,5 объем/объем). Цонтрпфугиру зт корости врашеиия центрифуги, соэ7ветстг(ую

щей 40ОО об/мш«, при температуре 0°С. 1 Плазму отбрасывшот и консервированные красные клетки (ККК) промывают 3 порциями 0,9%-ного физиологического раствора. ККК подвергают лизксу путем пятиминутной обработки ультразвуком при ко /шатной температуре.

После этого проводят диализ, помещая по другую сторону мембраны сначала дистиллированную воду, а затем - 0,О05М фосфатный буферный раствор с рН 6,0 в течение 24 час при температуре 4 С (четыре замены второй жидкости, объем каждой порции 4 л); увеличение объема соответствует 110%.

Подвергшийся диализу экстракт вносят в колонку (2,5x30 см) ДЭАЭ-целлюлозы, приведенной в состояние равновесия с 0,005М, фосфатным буферным раствором (рН 6,0). Колонку промывают при скорости течения 240 мл/час при помощи 0,005М фосфатного буферного раствора. Большая часть гемоглобина появляется при истечении объема элюента, соответствующего объему колонки, а остальную часть удаляют при введении дополнительных ;250 мл элюента (обШий объем 450 мл).

Элюирование оргртеина осуществляют при помощи 4 литров того же буферного растjaopa с повышающейся концентрацией хлорисггого натрия в пределах от О до 0,08М.

Измерение содержания меди и шшка и оптической плотности элюата и A,g производ5гг также,как в примере 1.

Диализ отобранной фракции, содержащей орготеин, проводят, помещая по другую сторону мембраны депонизированную воду, до установления проводимости, равной, приме1 но, 0,3-0,45 мком (обратные микроомы), фильтруют через фильтр с порами в 0,45м и лиофилизируют.

При этом получают примерно 52 мг of)готеина, выход которого составляет 0,013% из расчета на консервированные красные клетки; активность, из расчета на содазу, составляет 25ОО единиц/мг, что соответствует 75% общей активности орготеина, как перекисной дисмутазы, первоначально присутств)тошей в продукте лизиса.

Колонку регенирируют для пЬвторного применения путем промывания ее буферным раствором, ионная сила которого составляет, по меньшей мере, 0,1М и доходит до 2М с. последующим ополаскиванием депонизировсшной водой.

При применении способа, описанного в примере 2, чистый орготеин выделяют из красных кровяных клеток человека, кроликов, крыс и цыплят.

При применении способа, описгишого в примере 2, сходные результаты лолучены при использовании ТЭАЭ-иеллюлозы и имеющей поперечные связи декстрановой смолы содержащей диэтиламиноэтильные группы.

Формула Изобретения

Способ, выделения орготеина путем хроматографического фракционирования на ионообменных смолах орготеинсодержащего материала, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, адсорбцию орготеинсодержашего материала осуществляют на диэтиламиноэтил- и триэтиламиноэтил-целлюлозе при рН 6,0, элюируют буферным раствором с ионной силой не более 0,р2Мс последующей десорбцией целевого продукта градиентным .буферным раствором с ионной силой 0,02-0,ОЗМ с отделением фракций элюата с оптической

плотностью А

или А

содержащее

гйо

265

двухвалентные ионы меди и/или цинка.