Способ получения орготеина Советский патент 1976 года по МПК C07K14/46 C07K1/16 C12N9/48 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГОТЕИНА

ния растворителем, или сульфатам аммония и/или ультрафильтрацией или мембранным диализом.

Если белковые примеси остаются, они могут быть отделены после диализа, чтобы удалить протеолитически разрушенные белки путем адсорбции и последующим элюированием и слабо кислотной или слабо основной ионообменной колонки, или гелевой фильтрацией, хроматографией, фракцион-ное осаждение растворителем, например, ацетоном или этанолом, или сульфатом аммония и нагревание, например, .при 70-75°С, чтобы осадить оставшиеся белковые Примеси.

Пример 1. 1 кг бычьей печени смешивают с 2 л 0,025М тройного буфера, рН 7,5 в 0,ЗМ сахарозе и 0,05М КС1. Суспензию центрифугируют в течение 1-2 ч. Мутный верхний слой жидкости занимает объем 2150 мл и имеет рН 6,3-100 мл порция поверхностного слоя (60 мг протеина/мл, О-15 мг-0,3 мг орготеина/мл дигерируют при температуре окружающей среды в течение 20 ч в присутствии протеолитических ферментов: нроназы, панкреатина, субтилизина, нептидазы, папаина, бромелапна (ананаза).

Анализ электрофорограммы (после диализа для удаления разрушенных нротеинов и фильтрации) превращенного энзимами поверхностного слоя жидкости показывает, что при применяемых количествах 200 мг проназы и 15 мг Панкреатина они удаляют большую часть белковых примесей, следующий по эффективности субтилизин после папаина и бромелаина. Самые плохие результаты получают со свиной -пептидазой. Белковые примеси, оставшиеся после переваривания с панкреатином и бромелаином, наиболее легко удаляют ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе.

Пример 2. 408 г свежей печени смещивают с 816 мл 0,025М трис (тройной буфер),рН 7,5, в 0,3 сахарозы и 0,05М КС1.

Суспензию центрифугируют в течение 1 ч. Мутный верхний слой жидкости имеет объем 800 мл и рН-6,3.

100 мл порцию верхнего слоя жидкости, содержащую 15-30 мг орготеина, подвергают в течение 2 дней при 37°С дигерированию (перевариванию) с некоторым количеством протеолитического энзима, с добавлением азида натрия (0,1%) как предохраняющего средства с последующим диализом.

Лучший результат получают с панкреатином, проназой и субтилизином, остаточный протеин легко удаляют пз панкреатиновой выварки путем ионнобменной хроматографии с ДЕЛЕ-целлюлозой.

Пример 3. 300 г печени смешивают с 600 мл 0,025М тройного буфера 0,025М глизина в 0,01М Мп++, рН 7,5.

Смесь (шлам) центрифугируют. Остаток намного лучше уплотняется в этом буфере. Верхний слой жидкости (110 мг протеина) мл измеряется в 570 мл. Порцию подвергают ферментному перевариванию с панкреатином или проназой и подвергают диализу с целью отделения орготеина от деградированных протеинов.

У панкреатина приблизительно одинаковая эффективность при всех испытуемых концентрациях (3-150 мг/мл). Пропаза менее эффективпа, когда разведена от 2 мг/мл до 0,02 или 0,04 мг/мл.

Пример 4. 300 г бычьей печени смешивают с 0,025М тройного буфера, 0,025 мг лицина в 0,01М Мп++, рН 7,5 в соотношении 2 мл буфера на 1 г печени. Шлам центрифугируют в течение 1 ч (экстрагированные протеины, 60 г/л поверхностного слоя лсидкости; орготеин приблизительно 150 мг/л). Приготовляют раствор панкреатина (100 мг/мл) в 0,05М тройной НС1 - буфер, рН-7,5.

Верхний слой жидкости экстракта бычьей печени (рН 6,7) титруют до 7,5 рП с помощью 1М тройного буфера. К каждым 100 мл экстракта бычьей печени добавляют 6 мл (0,6 г) раствора панкреатина и 1 мл 10% азида натрия. Смесь (рН-7,5) инкубируют при 37°С в течение 2 дней, в течение которых цвет смеси меняется от красного до коричневатого (остаточный протеин, около 3 г/л, орготеин приблизительно 150 мг/л). Выдержанную смесь подвергают диализу через деионизированную воду в течение ночи и наконец в 0,005М. фосфатного буфера рН 6,0. Диализат центрифугируют в течение 1 ч и затем отфильтровывают через микрофильтр.

Фильтрат имеет рП 6,3.

Содержание орготеина в протеинах оставшееся в них, более чем 5% по сравнению с 0,2% в растворимых протеинах, экстрагированных из исходного шлама.

Чистый орготеин удаляют из фильтрата.

Диэтиламиноэтилцеллюлозную ионообменную колонку наполняют до 8,5 мл объема слоя. Уравновешивают 0,005М фосфатным буфером, рН 6,0. Скорость протока 20 мл в час. 253 мл фильтрата, эквивалентных 82 г печени, загружают в эту -колонку. Колонку потом промывают 30 мл 0,005М фосфатного буфера с рН-6,0. Орготеин подвергают элюированию с линейным градиентом от 0,005М фосфата, рН 6, до 0,005 фосфата в 0,075 рН 6,0, в общем объеме 170 мл.

Трубки, содержащие орготеин, без .примесей помещают в одну фракцию, а те, которые содержат орготеин вместе с некоторыми примесями- в другую фракцию. Обе фракции, каждая диализировалась, стабилизируют давлением сахарозы, если необходимо, фильтруют и лиофилизируют.

Выход чистого Орготеина 27,6 мл (0,034%) в расчете на исходное количество печени; 62% от теоретических. Выход чистого орготеина 10 мг, давая общий выхход орготеина 84% от теории.

Чистый орготеин быть рециркулирован или .далее очищен путем воздействия других протеолитических энзимов, например, про 1Г13Ы, или гелспон, или ионообменной хроматографией.

Пример 5. Чтобы определить эффект протзедения стадии гаротеолитического дигерирования на различных стадиях отделения орготеина, вся бычья тгечень, растворимые протеины из бычьей печени и растворимые протеины из бычьей печени, обработанные теплом, подвергают ферментной очистке панкреатином. Чтобы получить экстракт растворимых нротеинов из бычьей печеии, 500 г (150 г твердых веществ) бычьей нечени смешивают в смесителе с одним литром буферного раствора 0,25М тройного, 0,025М глицина и 0,01М Мп++, рН-7,5, чтобы получить 1380 г/мл смеси, 100 мл порции полученной смеси подвергают обработке по стадиям

A.Смесь центрифугируют, в течение 1 ч, получая 78 мл поверхностного слоя жидкости, содержащей 100% растворимых протеинов и 100% орготеина в исходной печени.

Б. 78 МЛ поверхностного слоя жидкости из стадии А подвергают протеолитическому разрущепию с помощью 300 мг панкреатина, pi-i-7,5; 24-28 час. 100% орготеина и общих растворимых нротеипов исходной печени остаются.

B.100 мл исходной печеночной смеси подвергают тепловой обработке при 65°С в течение 15 мин, охлаждают и цеитрифугируют, получая 78 мл верхнего слоя жидкости и 7,6 г/ (89,5%) осажденных нерастворимых протеинов.78 мл поверхностного слоя жидкости затем подвергают обработке энзимами стадии 100% орготеина и ;6% общих растворимых протеинов исходной печени остаются.

Г. 78 мл поверхностного слоя жидкости стадии А подвергают тепловой обработке стадии В. Выход от центрифугирования 60 мл (2,70 г твердых веществ) поверхностного слоя жидкости и 2,05 г осадка. 60 мл поверхностного слоя жидкости затем подвергают обработке протеолитическими энзимами стадии Б. Остается 3-6% растворимых протеинов. Тепловая обработка перед стадиями энзимной обработки делает последнюю более эффективной, потому, что на стадиях В и Г остается

только 3-6% растворимых протеинов, тогда на стадии В остается больще чем 6%.

Формула изобретения

Способ получения орготеина из экстрактов животных тканей путем хроматографического фракционирования, отличающийся тем, что, с целью повыщения степени чистоты целевого продукта, экстракт предварительно обрабатывают протеолитическим ферментом.