Раствор лизата Советский патент 1978 года по МПК A61K35/56 

(54) РАСТВОР ЛИЗАТА

Изобретение относится к области и может быть использовано для диагностических целей. Известен раствор лизата на основе растворимых кровяных клеток Zimulus 1. Однако известный раствор не обладайi высокш чувствительностью к эндотоксину. Целью изобретения является повышение чувствительное™ к эндотоксину. Эта цель достигается тем, что он дополнительно содержит по крайней мере один компонент- выбранный КЗ следующих групп: HOHoretiHoe соединение магния, лития, строшщя, бария, имидазола, цис теина в концентрации 0,005-0,3 моль/п раствора. Эти KOMiioHCHTM могут 1,рисутствовать в ртство ре лизата в следующих концентрациях: имидазол 0,004-0,4 моль/л, предпочтительно 0,01-0,3 моль/л, марганец, предпочтительно в виде ионов ( ) в количестве 0,005-0,1 моль/л, ионы стронция (Sr) обычно 0,005-0,4 мол1./л, предпочтительно 0,01-0,3 моль/л ноны бария () обычно 0,0050,5 моль/л в присутствии буфера для создания рН 7-10, цистеин - обычно в концентрации 0,0050,3 моль/л, ионы лития ( Ь ) 0,005--0,3 моль/л, предпочтительно 0,3-0,15 моль/л. Ионы магния сами но себе обеспечивают хорошую чувствительность протеина Limulus, если они присутствуют совместно с ионами натрия ( не более чем 0,1 моль/л ионов натрия), которые проявляют чувствительность ;шзатного протеина по отношению к эндотоксину, даже в присутствии других катализаторов. Предпочтительно, чтобы в литре {иствора присутствовало от 0,5 до 0,3 моль/л Мд t Предпочтительно имидазол использовать в растворе .пизата совместно с ионами Li , ионами Мд , ТИОГШ1КОЛЯТ ионами (которые мо.ут быть добав1гены в виде тиогликолята щелочного металла, например тиогликолята натрия) или ионами Sr . Комбинация этих ионов с имиддзолом, действующая как буферный агент, обеспечивает высокую чувствительность лизата на присутствие эндотоксина. Например, при использовании совместно с имидазолбм, взятом в предпочтительном интервале кон- центраций,, приведенном выше, хорошие результаты нол чают в результате добавления 0,005-03 моль/л ионов Lf , предпочтительно 0,2--0,15 моль/л ионов L или 0,005-0,3 моль/л ионов Мд , предпочтительно 0,01-0.1 моль/л HOFiOB Mg Хорошую комби1Ю1ШЮ пол чатт, сс.чи и тидазол и ионы Мд добавляют в их прошочтитгльны

концентоациях, а ионы таюгликоляха добавляю с концентращей 0,005-ОДЮ8 моль/л растаора.

Хорошие результаты получают при добавлении к имидазольному раствору ионы стронция концентрации 0,02-0,15 моль/д.

Приведенные вьпое положительно заряженные ионы можно добавлять к раствору в виде соо1вет етвуюидах хлорвдов.

Ионы стронция обычно добавляют в виде хлорида стронция, ионы бария (Ва используют совместно с буфером и эквивалентными буферньцуш агентами, особенно в тоМ: случае, когда буфер присутствует в такси концентрации, чтобы обешечнть рН 7-ю.

Известны и эквивалентные сульфопщрильньц соединения, такие как глютатион, гаогликолят щелочного металла или тиоурацил, проявляющие спо собность повышать чувствительность лизата. Хорошие результаты получают тогда, когда гицрохлорид цистеина нейтрализуют до рН 6-10 щелочным веЩеством, таким как гидроокись натрия, карбонат калия, гидроокись тетрабутиламмония, а такя№ при использовании в растворе лизата 0,02-0,2 вес.% сульфопщрилсодержащего соединения, такого кап цистеин или шоглико;штная соль щелочного металла, 0,2-2 вес.% воднорастворимой соли магния, такой как хлористый магний.

Ионы лития вводят с хлористым лигием или подобными солями лития, имеющими растворимый aifflOH, для повышения чувствительности.

Каталитические или повьшиющие чувствительность агенты используют путем первоначального растворения в дистиллированной воде в желаемых концентрациях. После этого полуаднные растворы используют для перестройки лиоф1ишзировашюго лизата путем растворения лизата в этом растворе.

Растаоры лизата обычно готовят непосредственно перед использованием из-за их повышенной чувствительности по отношению к эндотоксину, которая повьшиет вероятность их осаждения наличия случайных примесей, что имеет место при длительном хранении.

Р&створ гшзата - это водный раствор, свободный от пирогенов, использование которого позволяет избежать преждевременного осаждения лизата, однако могут быть использованы и неводные растворители, такие как метанол, этанол, изопропанол, ацетон, этиленгликоль и другие, которые также использоваться в смеси с водой, при необходимости.

Пример. Собирают Атдантических ме«хвостов (Limulus Polyphemus) и помещают их в штатив таким образом, чтобы удерживать в положении, при котором их брюшные стороны находятся сверху. Стьпс между двумя первыми сегментами крабов (простома и опситома) подготавливают в результате протирания спиртом. Затем в место сошенения вводят иглу для отбора крови, которую устагавливают на конце сосуда для крови, ио модифицированной таким образом, что трубка для

4

отбора крови имела длину в 5 дюймов (12,5см). Сосуд содержит 300 мл 3%-ного раствора хлористо го натрия, в котором растворено 2,87 г этилеьздиаминтетраацетата (ЕДТА).

Из мечехвостов отбирают в сосуд для сбора крови100 мл крови.

сосуда выбирают и балансируют, если это нвобходимо по весам и затем помещают в цетрифуту на 7 мин при 17.800 об/мин для того, чтобы отделить клетки амебоцита от крови. В тех случаях когда кровь хорощо седиментироваш, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 7 мин.

Вслед за стадией центрифугирования клепси каждьш сосуд с кровью помещают на наклонную плоскость с углом наклона 10° таким образом,, чтобы закупоренный конец трубки для сбора крови бьш направлен вниз и трубку для сбора крови еще раз открьтают, разрезая ее. Верхний слой тщательно декантируют, оставляя осажденные клетки в сосуде. Вслед за стадией декантации трубку для сбора снова за1шивают.

Затем в одну из i двух стерильных дфполнительных частей сосудов с кровью вводят с поыощью инъекционной иглы 6 вес.ч. дистиллированной, непирогенной воды на каждую 1 вес.ч. ктюток присртствующих в сосуде для осуществления лизиса клеток. Вес клеток может быть определен в результате вычитания ставдартного сухого веса сосуда для крови от действительного веса сосуда и клеток, которые содержатся в нем.

Дистил;шрованкую воду перемешивают в сосуде для крови и затем дают стоять в течение 24 ч при 4° С. Затем сосуд центрифугируют в течение 7 мин. После этого жидкое содержимое каждого из сосудов пропускают через 170-микрончый фильтр для отделения его от осажденных таердых веществ и помещают в заморахашающую среду для нолучеНИН твердого замороженного состояния.

Замороженный l.imutus лизаткьв раствор затем тщательно оттаивают, обеспездтая такой рейсим, чтобы раствор оставался холодным (т.е. 20°С). После оттаиваш1я лизатный раствор перефильтров ьшают Е колбу через дополнительный 1 0 микрошо ш фильтр.

Осадок на фильтре, остающийся после фильтрования, представляет собой нежелательньш материал, который осаждается во время стадии рыморажива1шя. Затем фильтрат обычно отфильтровьюают еще раз через другой фильтр {имеющий номинальный размер пор порядка 1,5 мкм с последующей фильтрацией через мембрашП)Ш фильтр, который имеет абсолютный размер пор порядки 1,2 мкм и номитльный размер пор менее этого значения.

Перед использованием все фильтры промьюали I л стерильной непирогениой воды. Последние стадии фильтращ-ш осуществляют в результате сжг тия лизатного раствора в направлении течения через фильтр при помощи давления газообразного азота, равного приблизительно 0,9 кг/см. С друг( стороны, в сборном сосуде можно применять вакуумирование для облегчения фильтрации. После последней стадия фильтрации раствор разделяют иа 2,0 аликвоты, которые помещают в б мл акшулы или испьпательные пробирки, которые тщательно промывают стерильней, не содержащей пнрогенсга водсж, и депирогенируют при температуре 245° С в течение 4 ч. Ишытательные пробирки затем запаивают, подвергают полочному вымора живанию в машине для лиофияизации и сушат иа холоду до образования сухото порошка. Ряд испытательных пробирок, приготовленных как описано вьпие, подвергают перестройке в виде раствора в результате добавления S мл одного из раствс кт, описанных 1шже. В каждой серии пустых нтытательных пробирок, за исклияением первст пробирки каждой серии, добавляют0,1 мл непирогенной воды. В первую пробирку добавляют 0,2 мл Е .coEt стандартною эндотоксишюгр раствора. Концентрация исполь зуемогоЁ оЕ эндотоксииа (Составляет 100 нанограмм зндотоксина на 1 мл. После этого О, мл раствора из пер9ой пробирки добавляют во вторую пробирку; 0,1 мл раствора из второй пробирки добавляют в третью пробирку; и такое добавление продол жаюг до образования серий последовательных испытательных растворов, каждьш из которых содержит половину концешрацш предыдущих иохытатель ных растворов таким образом, что двадцатью и по Используемый перестраивающий раствор,

09 NaCt (контроль)

0,085 цистеиш НС

0,1 цистеина

0.001 реагента Клеланда

0,2 2-тио-6-амино)фацила

Смесь равных объемов: 1

раствора Мд Clj и 0,85

цистеина НС

Смесь равных объемов: 1

раствора Мд Clj и 0,1

цистеина

Смесь равных объемов: 1

MgClj и 0,1 раствора

тиогликолята натрия

Смесь (3:2):1 раствора

Мд Clj и 0,1 раствора

тиогликолята натрия

Смесь (2:1:1):1 раствора

Мд Clj, 0,9 раствора

CaClj и 0,85 раствора

и-:иистеина HCI

Смесь равных объемов:

Мд SO4, 0,2 2-тао-6-аминоурацила и 0,1 тиогликолята

натрия

1,56 (растаор N 7) 0,39 (раствор N« 9) 0,195 (раствор N Ш) 0,39 (раствор W 9) 0,195 (растаор ff 10).

0,097 (раствор № 11)

0,097 (раствор N 11)

0,097 (раствор N 11) иногда 0,048 (раствор № 12)

0,195 (раствор N 10)

0,195 (раствор N 10)

0,195 (раствор № 10) 0,39 (раствор N 9) следний испытательный раствор содержал 0,00019 нанограмм эндотоксина на 1 мл. К К1 ждому выбранному интервалу раствора в полученных пробирках добавляют 0,1 мл перестроенного лизатонного раствора. Серии пробирок затем инкубируют прт температуре 37 С в течение 60 мин. Затем каждую пробирку переворачивают и отмечают наличие кли отсутствие неповрежденного тромба протеина. Наличие протеинового тромба, способного оставаться неразрушенным в результате мягкой инверсии испытательной пробирки, служит указанием положительной чувствительности реакции лизета на эвдотоксин. Ниже показано, что природа перестра1шанщего раствора в значительной степени влияет на чувствительность лизата по отношению к эндотсяссину представлены различные перест аиваницие расгеоры, которые подвергают испытанию и перечислены для каждого случая максимально разбавленные растворы зидотоксмка, которые способны вызывать положительную реакцию на прочность тромба Limukis лизатом : после перестройки в специальных растворах, перечисленных ниже. В целях сравне1Шя, при испытании IB кролике дня паренгеральньЕХ растворов больщих объемов обычный предел детектирования составляет 0,097 наиограмм эндотоксиш на 1 мл. (1 створ 11). --, .- Низшая концентрация зндотоксиниого раствора, способная давать положительную реакцию иа прочность тротйба, (нан«грамм/мл)

7

П р и м е р 2. Образцы различной партии лиофилизироваиного Limulus лйзата, полученного в примере 1, подвергают перестройке по способу, описанному в примере 1, с помощью 2 мл перестраиваюДобавки в используемый перестраивающий раствор

Стерильная вода (контроль) бе

и шдазола

Без добавок - только имидазол

0,1 м LiCI

0,5 М LiCI

0,025М LiCI

0,0125М LiCI

0,2М LiCI

0,Ш Мд СЬ

0,05М Мд Clj

0,025М Мд

0,12SMMgCl2

0,00625М Мд Clj

Повторение этого эксперимента с использованием 12М стерильного имидазольного раствора (рН 7,07) привело в результате к положительной реакции на тромб при концентрации эндотоксина порядка 0,048 нанограмм/мл (раствор № 12).

0,2М SrClj 0,1 М SrCli 0,05М SrClj 0,025М SrCb 0,0125М ЗгСЦ

Примерз. Образцы лиофилизированного Limulus лйзата, полученные согласно примеру 1, подвергают перестройке способом примера с помощью 2 мл перестраивающего раствора, включаюДополнительнью инградиенты перестраивающего раствора

Без добавок - только имидазол

0,005М тиогликолята натрия 0,0025М тиогликолята натрия 0,00125М тиогликолята натрия

щего раствора, состоящего из 80 06.% стерильной воды и 20 об.% 0,13 имидазольного .буфера (рН6,8). и включающего также дополнительные добавки в концентращшх, указанных ниже.

Низшая концентрация раствора эндотоксина, способная давать положительную реакцию на прочность тромба, нанограмм/мл

3,12 (раствор № 6) и и

1,56 (раствор № 7)

0,195 (раствор W 10)

0,097 (раствор № 11) и

0,048 (раствор N 12)

0,097 (раствор N415

0,097 (раствор №11)

0,097 (раствор № II)

0,097 (раствор № 11)

0,097 (раствор № II)

0,048 (раствор № 12)

0,048 (раствор N 12)

0,048 (раствор № 12)

3,097 (раствор №11)

0,097 (раствор № 0,048 (раствор № 0,048 (раствор № 0,097 (раствор № 0,048 (раствор №

щего в свой состав 0,12М имидазола (рН 7,04), а также включающий дополнительные инградиенты в ко1Щ(нтрациях, указанных 1шже.

Низщая концентрация эндотоксина, способная давать положительную реакцию на прочность тромба, ианограмм/мл

0,097 (раствор № 11) 0,048 (раствор № 12) 0,048 (раствор № 12) 0,048 (раствор № 12),

П р и м е р 4. Образцы лиофилизировашюго Limulus гшзата, полученные как описано в примере 1, подвергают перестройке способом примера 1 с

Используемый перестраивающий раствор

Стерильная вода

0,1М Мд Cl2 0,1М имидазола и

0,005М тиогликолята натрия,

0,05М Мд Cli, 0,05М имидазола,

0,0025М тиогликолята натрия

0,02 5М Мд Cl2, 0,025М имидазола

и 0,00125М тиогликолята натрия

0,0125М MQ СЬ ; 0,0125М имидазо

и 0,000625М тиогликолята натрия

0,05М 0,05М LiClj и

0,05М имидазола

0,025М MgClj; 0,025М LiCij и

0,025М имидазола

0,Ш Мд Clj; 0,1М

0,1М имидазола и 0,005 М

шогликолята натрия

0,05М IVfe СЬДОЗМ LiClj; 0,05М

имидазола и 0,0005М тиогликолят

натрия

0,025М Мд CI2, 0,025М LiCI, 0,02

имидазола и 0,00125М тиогликоля

натрия

0,1М LiCl2, 0,1М имидазола и

0,0051Й тиогликолята натрия

0,0005М то же

0,00025М то же

0,0000625 то же

0,2М SrClj

0,5М SrClj

0,0125М SrClj

0,2М SrCl2 в растворе трис-буфера при рН 9,3

0,Ш SrClj в растворетрис-буфера с рЦ 9,3

Раствор трис-буфера (контроль

для данных по влиянию SrClj

(рН 9,3)

0,2М BaCl2

0,05М ВаСЬ в растворе трис-буфера (рН 9,55)

10

помощью 2 мл различных перестраивающих растворов, как описано киже.Эндотоксинная чувствительность по лученных в результате продуктов представлена ниже

Низшая концентрация эндотоксина, способная давать положительную реакцию на прочность тромба, нанограмм/мл

П

При концентрации 0,78 (раствор № 8) не удало положительную реакцию

0,195(раствор N 10)

0,097(раствор №11)

0,048(раствор № 12)

0,195(раствор № 10)

0,097(раствор N 11)

0,097(расгвор № 11)

0,097 (раствор № 11) 0,097 (раствор № 11)

0,097 (раствор )

0,097(раствор №11)

0,195(раствор №10)

0,097(раствор )

0,195(раствор NMO)

0,097(раствор №II)

0,097(раствор )

0,097(раствор №11)

0,048 (раствор NM2) 0.048 (раствор N 12)

0,39 (раствор ) ОЛ95 (раствор № 10)

0,097 (раствор № 11)