Способ культивирования микроорганизмов Советский патент 1978 года по МПК C12K1/06 

(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ AW КРООРГ А Н ИЗ MOB

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается кулитивирования микроорганизмов в питательной среде. Известен способ культивирования микроорганизмов в питательной среде, содержаш,ий кислый фосфат калия, аммониевую соль сильной минеральной кислоты и источник углерода, при поддержании рН путем добавления источника углерода и основания 1. Однако такой способ не обеспечивает эффективного культивирования микроорганизмов, Целью изобретения является повышение эффективности культивирования. Это достигается тем, что рН питательной среды поддерживают в пределах 2,0-6,0 введением неорганического основания и источника углерода, который вводят в количестве 75-85°/о от теоретически требуемого, при этом остальное количество вводят в течение 5-120 сек с момента повышения концентрации кислорода на 10-80% от концентрации насыщения. Кроме того, в качестве неорганического основания используют аммиак, а в качестве источника углерода - этанол или н-алканы. Питательная среда включает в свой состав минеральные соединения, содержащие необходимые элементы, в том числе рассеянные элементы и источники углерода такие, как углеводороды, особенно н-алканы. метанол, этанол, уксусная кислота, сахароза, глюкоза или сульфитные растворы. Если источник углерода не растворим в воде или если это необходимо, то eio вводят из отдельного дозатора, а не совместнее с основание.м. Теоретическое количество источника углерода составляет то количество, которое можно рассчитать но среднему содержанию азота в образующейся биомассе и коэффициенту выхода. Постоянной насыщения является концентрация углерода, приводящая к снижению скорости роста на половину максимальной величины. Концентрация кислорода в установившемся состоянии в культивируемой среде составляет определенную концентрацию кислорода, растворенного в культивируемой среде, которая имеется в том случае, когда существует оптимальная концентрация источника углерода. Концентрация насыщения кислорода в куль тивируемой среде составляет максимально возможное количество кислорода, которое может быть растворено в культивируемой среде при температуре и дав.чении культивирования независимо от того, являются ли другие условия культивирования оптимальными. Количество

источника углерода, вводимого отдс,1ьно д.1Я регулирования углеродного ба.чаиса, должно быть доотаючным, чтобы вызвать снйженнс концентрации растворенного кислорода до концен1 рации в установившемся состоянии за время от 30 до 120 сек (нредночтительно за 30 сек)

Микроорганизмы, которые могут быть использованы, включают в свой состав бактерии, дрожжи и плесени, например Candida utilis и Candida lipolytica.

Пример I. Культивирование дрожжей Candida utilis проводят в бродильном чане общим объемом 30 ,1 и рабочим объемом 15л в среде, в которой в качестве источника углерода используют синтетический этанол. Бродильный, чан с.чабжен механической мешалкой и скорость растворения кислорода достигает 280 молей кислорода в 1 час на 1 л. Сырой использованный этанол содержит 90 об.°/о (85,7 вес.%) )l а.

I (итате.чьная среда дтя выращивания Юг/л сухих дрожжей содержит иервоиачально на 1 л, в г:

(.1-1д) .60.4

,0,8

MgSO,,O0,25

ZHSO -ri-bO0,01

К 15 л основной среды в бродильном чане с рН 4,5 добавляют закваску, соответствуюилую начальной концентрации сухих дрожжей 2 г/л и 15 м.т этанола. После этого начинается процесс культивирования, протекающий при 30°С. рН среды регулируют так, чтобы его величина составляла 4.0. Для этого -используют однонозицнонный регулятор с заданным значением 4,0. Если рП культ1 вируемой среды иадает ииже 4,0, то сигнал, н(х:тупающий из рН-метра включает .дозатор, нри ио.кици которого вводят в CMCCS-J аммиака и этанола. Отнои1ение аммиака к синтетическо.му этанолу, которое необходимо взять, рассчитывают, исходя из содержания сухих дрожжей (10 г/л, т. е. 150 г) и()едиолагаемого содержания азота ( на вес сухой биомасеы) и коэффицнента вы.хода (0.68). На основании этого расчета но,:;уча1от смесь аммиака и 80% от раечетно1о ко;|ичестиа этанола.

Не.т.оста1 ок источника уг.лерода в культиги руемой среде зафиксирован в течение 5-10 сек на осиове быстрого повыщения концентрации кие.юрода, которая увеличивается от 10 до ЗО-/о от концентрации насыщения, определенной нри НО.МО1ЦИ анализатора для растворенного кислорода полярографического тина.

Фстоэлектрический регулятор, соединенный с кнслородным анализатором, подает сигнал, который OTKpiiiBaeT дозатор. Из дозатора вводят донолнительный этанол. После добавления этанола концентрация растворенного в куль:ивациотюй среде кислорода иадает примерно в течение 10 сек до 10% от концентрации iiaebiHxeiniH. Затем вновь проводят дозирование этанольной с.меси. Приблизительно 20% от общего количества юглошенного этанола вводят дополнительным способом. Общее количество поглощенного : процеесе -ультивирования этанола соетавл п- 220 г абсолютного

этанола. Процесс культивирования заканчивается через 6 час. Из 1 г абсолютного этанола получают 0,64 г сухого вещества дрожжей с содержанием 0,408 г сырого белка. Сухое вещество биомассы содержит 9,8/о нук.леиновых кислот.

Пример 2. Культиви)оваиие Д1;ожжей Candida lipolvtica в присутствии отдельных парафинов в качестве источника углерода проводят в том же бродильно.м чане и с использование.м тех же основных материалов, что и культивирование, описанное в примере 1. Использованные парафины содержат 99,5 вес.% н-алканов, больн1инств() углеводоро;; в имеет 14-17-у леродиых атомов и их и.ютность составляет 0,97 г/см. К 15 л основной среды добавляют закваску в количестве, соответствующе.м начальной концентрации сухих дрожжей 2 г/л и 10 н-алканов, необходи.мых для инициирования процесса биосинтеза.

Затем начинается процесс культивирования, который протекает при температуре 34С и р14 4,5. Для регу.шрованин величины рН и автоматического дозирования н-алкапов исно.1ь зуют однопозиционный регулятор с заданны.м значением рН 4,5. Еели рН культивируемой среды падает ниже 4,5, то сигнал, поступающий из рН-метра, открывает дозатор, нри по.мощи которого осуществляют подачу с.меси а.ммиака и н-алканов. Отношение ам.миака е отдельным н-алканом рассчитывают исходя из выхода сухой дрожжевой биомассы (10 г/л), иреднолагаемого содержания азота (9.5%), а также коэффициента выхода (Г). Готовят смееь а.ммиака и 80/о от расчетногО коли:сства н-алканов. .А.ммиак разбавляют во то; до того же объе.ма, что и н-алканы и е .с„иненные дозаторы вводят одинаковые объемы аммиака и н-алканов. О недостатке источника углерода в культивационной среде свидетельетвует быетрое повышение в течение 120 сек концентрации растворепиого кислорода от 20 до 60%, .от концентрации насыщения. Используют анализатор растворенного кислорода гальванического типа.

Фотоэлектрический регулятор, соединенны с кислородным a aлизaтopoм, подает сигиал, который открывает клапан, регул фую ций введеиие дополнительного количества н-алканов. Дополнительно вводят пример ю 20% от расчетного количества н-алканов. Процесс культ вирования заканчивается через 6,5 час, когда достигается заданнь Й выход сухой био.массь.

Полученный .матер 1ал содержит 138 г сухи.х дрожжей, что соответствует коэффицие ту выхода 1,05, т. е. 1 : н-с1.1канов получаю 1, 05 г еухого вещества дрожжей. Полученная биомасса в пересчете на сухое вещество дрожжей содержит 9,0% азота, 6,2% липидов и 0,25% неис 1ользованнь х углеводородов. С хое ве1дество биомассы содержит 8,2% нуклеиновых кислот.

Пример 3. Культивирование бактерий Methylomonas methanolica на метаноле как единетвенрюм источнике углерода производят в то.м же бродильном чане, что в примере 1. Концентрация используемого метанола 98 об.%).

Питательная среда для выращивания Юг/л по сухому BeuiecTBy содержит в (в г): NH,ЬSO40,5

КН2РО40,8

MgSO.r7HjO0,25

ZnSOVTUzO0,0001

FeCU-BHsO0,008

Сааг-2НаО0,0003

CuSO4-5H.,00,0001

MnSO HzO- 0,0001

СоСи-бНзО0,0001

К 15 л основной питательной среды добавляют закваску в количестве, соответствующем первоначальной концентрации 2 г сухого бактериального вещества в 1 л, и 10 мл метанола, необходимо для начала процесса. После этого начинается культивирование при температуре 30°С и рН 6,0.

При понижении рН среды ниже 6,0 импульс от рН-метра включает соединенные дозаторы смеси раствора аммиака и метанола. Необходимое количество аммиака и метанола рассчитывают на прирост 10 г/л бактерий по сухому веществу, на предлагаемое содержание азота в сухом веществе биомассы (12°/о) и на коэффициент выхода (0,5).

Для приготовления смеси метанол-аммиак берут метанола 80% от рассчетного количества и аммиака все рассчитанное количество.

Недостаток источника углерода в культивационной среде сопровождается быстр|,1м повышением концентрации растворенного кислорода (в течение 10-15 сек) с 15 до 35% от концентрации насыщения. Концентрацию растворенного кислорода в питательной среде измеряют с помощью полярографического анализатора растворенного кислорода, снабженного фотоэлектрическим регулятором, который дает импульс при повыщении концентрации растворенного кислорода до 30% от концентрации насыщения на открывание вентиля для нодачи

метанола. Для дополнительной дозироики используют 20% метанола от его общего рассчетного количества.

Абсолютное количество метанола для дополнительной дозировки составляет 60 г. Общий расход метанола при культивировании составляет 300 г.

Культивирование заканчивается по истечении 15 час. Выход 0,48 г сухой биомассы из 1 г метанола, сухое бактериальное вещество содержит 13% азота, 81% c{ iporo белка и 13% нуклеиновых кислот.

Предлагаемый способ обеспечивает высокую эффективность культивирования микроорганизмов.

Формула изобретения

. Способ культивирования микроорганизмов в питательной среде, содержащей кислый

фосфат калия, аммониевую соль си,1ьной минеральной кислоты и источник углерода, при поддержании рН путем добавления источника угле рода и основания, отличающийся тем, что, с целью повыщения эффективности культ111;;|рования, рН питательной среды поддер 1-;;п ают

в пределах 2,0-6,0 введепием неорганического основания и источника углерода, который вводят в количестве 75-85% от теоретически требуемого, при этом остальное количество вводят в течение 5-120 сек с момента повышения

концентрации кислорода на 10-80% от концентрации насыщения.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент Великобритании jVs 1392771, кл. С 6 F, 1974.