Способ получения биомассы Советский патент 1974 года по МПК C12C11/08 A23J1/18 

Изобретение относится к микробиологии.

Известен способ получения биомассы путем выращивания микроорганизмов в водной питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в присутствии минеральных солей при аэрации кислородсодержащим и углеводородсодержащим газами, регулировании общего парциального давления кислорода и общего давления в питательной среде с последующим отделением микроорганизмов от питательной среды.

Цель изобретения - улучщение условий выращивания.

Это достигается тем, что регулирование давления кислородсодержащего газа и углеводородсодержащего газа в водной питательной среде осуществляют так, что оно обеспечивает весовое отнощение растворенного кислорода к растворенному углероду в среде до 5-кратного по Сравнению со стехиометрическим весовым отношением потребленного кислорода к потребленному углероду при образовании биомассы, при этом производят одновременное регулирование общего давления газа и общего парциального давления кислорода, чтобы в среде было менее чем 30 ч/млн общего растворенного кислорода.

Для проведения описываемого процесса выбранный микроорганизм; использующий углеводород, или смесь микроорганизмов и водная питательная среда загрул аются в бродильный чан, приспособленный для поддержания давления выше атмосферного. Особенно полезны микроорганизмы, использующие метан рода Bacillus, Pseudomonas к Methanomonas, в особенности микроорганизм рода Pseudomonas ATCC-2I, 310, который в выделенном сухом состоянии является полезным как пища или

корм или кормовая добавка. Водная питательная среда содержит наряду с водой питательные минеральные соли, включая ион аммония или нитрата, как источник азота и имеет рН около 7,0.

Брожение проводится при комнатной температуре путем подачи в бродильный чан углеводородной текучей среды и воздуха или другого кислородсодержащего газа таким образом, что сумма парциальных давлений в углеводородном питании обеспечивает весовое отношение растворенного кислорода к растворенному углероду в бродильной среде примерно до 5-кратного по сравнению со стехиометрическим весовым отношением потребленного

кислорода к потребленному углероду при образовании биомассы, и общее давление кислородсодержаших газов подачп и парциальные давления кислорода аналогично регулируются так, чтобы в среде обеспечивалось от 0,0001 до

0,0090% всего растворенного кислорода.

Полученная биомасса отделяется от остающейся жидкости, промывается и может использоваться или может быть высушена и затем использована как пищевой проду кт или добавка к нему,

Используемый микроорганизм Pseudomonas metlianica (AlCC-2i, 310), использующий углеводороды, может быть описан как состоящий в молодых культурах из больщих грамнегативных лалочек щириной 1-3 мк и длиной 4-8 мк. По составу брутто клеточные продукты по весу содержат Ьи-70% белка, 2U-4U7o углеводородов, 2-iU7o жира и 2-б7о золы. Организм может быть культивирован и выделен из различных сред минеральных солеи. Предпоч1ительным источником азота является ион аммония или из аммиачных солей, или из аммиака, но могут применяться другие источники азота (за исключением элементарного азота), например нитраты. Субстратом быть метай или природный газ различного состава и кислород или воздух с углекислотой или без нее. Микроорганизм Pseudomonas (AiCC-21, 31U) будет расти в присутствии метана или метанола и может использовать некоторые высшие углеводороды, например гексан, когда растет в метане. Метан должен присутствовать в пределах от 1 до 97 об. %, кислород может подаваться в широком пределе концентрации вне токсичных количеств в газе нитання. Ион магния является важным ионом (иредиочтительио от 0,005 до 0,35 г/л иоиа магния). Ион кальция в виде растворимых солей должен присутствовать в среде в концентрации не менее 0,00025 г/л. Ион железа в виде растворимых солей должен присутствовать в среде в концентрации не менее 0,0001 г/л. Микроорганизм Pseudomonas (AiCC-21, 310) может использовать различные неорганические источники азота предпочтительно с ионом аммоиия в концентрации от .0,1 до 5,0 г/л. Скорость роста микроорганизма Pseudomonas почти нулевая при и при 40С, умеренная при и оптимальная при 30-ЗЬС. Бремя удвоения организма зависит от условий роста, например, непрерывности потока или статического состояния газа питания во взбалтываемых сосудах или в непрерывных системах , где лимитирующие факторы не присутствуют и время поэтому изменяется от 5 до 100 час.

Микроорганизм АТСС-19, 385 является смешанной культурой, выделенной из почвы или растения элодиа и определенной среды минеральпых солей и атмосферы, содержащей метап, кислород, углекислоту и азот. Этот микроорганизм содержит грам-отрицательные палочки шириной 0,5-3,0 мк и длиной 2-10 мк в качестве преобладающего организма, малую бактерию и дрол жевые клетки.

Большая часть организмов подвижна и несколько неустойчиво окрашивается по Граму, но обычно они умеренно грам-отрицательны. АТСС-19, 385 растет только в присутствии метана, но при росте в метане может использовать высшие углеводороды. Кислород в газе питания может подаваться с высокой концентрацией. Углекислота не существенна для роста, но является предпочтительным компонентом гааз питания. АТСС-19,385 может использовать различные неорганические источники азота. Рост происходит в температурном пределе от 10 до 55°С и при рП от 5,0 до 8,0. Оптимальный рост при 20-37°С и рН от 6,5-7,5,

Для выделения культуры пользуются стандартным методом, но применяют питательиую среду из минеральных солей, почти свободную от меди и цинка, за исключением малых количеств в виде загрязнений в других солях.

Типичная солевая среда (2/500 мл) для выделения:

Количество, г

1,0 2O

ОД

0,045

0,01

0

0,001

0,0002

П2О

0,0002

0,0002

0,00004

Выделение культуры происходит следующим образом. В каждую из нескольких стерильных 250 мл колб Эрленмейера вносят 50 мл стерильной среды из основных солей, описанных в табл. 1, ночти не содержащих меди п цинка.

В среду каждой из нескольких колб затем добавляют малыми порциями, например 0,5 г, образцы растения элодия. В несколько дополнительных .колб добавляют 0,5-1,0 образцов почвы. Почву можно брать из любого места,

но почвы городских иредместей предпочтительнее, так как воздух в таких районах загрязнен метаном и культура получается легче. Содержимое колб перемешивают и насыщают газовой смесью, содержащей метан. После плотного закупоривания колбы инкубируют при 30-35 С и время от времени встряхивают. Газовая смесь обновляется через каждые две недели. Признаки роста культуры появляются через 3-6 недель, когда растущую культуру

переносят в новую среду.

Подготавливают новый комплект стерильных колб, содержащих по 50 мл стерильной среды. Исходные колбы, содержащие растущую культуру, хорошо встряхивают и из каждои колбы 2 мл суспензии переносят в новую колбу. После перемешивания новые «олбы инкубируют при 30-35°С после насыщения стандартной газовой смесью. Как и прежде колбы периодически встряхивают и снова газируют

через некоторые промежутки, примерно через 2-4 недели. В это время растущую культуру переносят во взбалтываемую колбу и в чашку с агаром. Для этого приготавливают агаровые чашки со стандартной основной средой и заражают элодией или почвенными микроорганизмами по обычному бактериологическому методу.

Эти чашки ставят непокрытыми в газоплотный эксикатор с возобновляемой атмосферой. Через 2-4 недели появляются белые или желтоватые колонии. Одну или несколько таких колоний переводят во встряхиваемую колбу. Растущую культуру применяют для заражения питательной среды для роста клеточного материала.

Пример . Усиление роста Pseiidomonas methanica (АТСС-21, 310) при различных питательных газах п увелнченных давлениях ноказывается путем сравнительных результатов, приводимых в табл. 1. Условия ферментации:

Таблица 1

Склянки емкостью 200 мл под давлением (№ 23187 фирмы luton Гласе К°), 100 мл ереды 377 (см. Гирш и Конти Arch. MicTobiolog 48,339-57, 1964), 1,0 мл посева для индукционного периода, ручная мешалка, комнатная температура, указанные статические давления, выполняемые через 0,22, 46 и 65 час. Через 65 час ферментации в К льтурах 4 и 9 давление 0.

Из таблицы видно, что, .когда концентрация растворенного кислорода менее 30 ч/млн независимо от давления питательного газа и отношение растворенного кислорода к углероду приблнзительно соответствует отношению потребленного кислорода к углероду, то скорость роста организма и клеточная плотность наивысшие.

Пример 2. Эффект концентрации кислорода на рост АТСС-19, 385 при различных давлениях в склянках показывается сравнительными результатами, приведенными в табл. 2.

Таблица 2

Условиями ферментации: склянки емкостью 200 мл (№23187 фирмы luton Гласе К°),50мл среды 691, стерилизованной автоклавированием, 2,0 мл посева для культур 1-5, 1,0 мл посева для культур 6-10, комнатная температура, механическая мешалка, статистическое давление питательного газа во время отбора образцов, питательный газ состава (в %): 35,5 СН4, 0,42 СзНб, 0,05 СзНз, 0,09 СОг, 1JO О2, 0;08 Аг, 62,2 Ng, приготовленный из сухого воздуха баллонов Матесона, технического метана и очищенного азота.

Состав среды 691 (в г/л): 3,24 К2НР04; 2,72 КНгРО ; 1,5 (NH4)9-HPO4; 0,25 MgSO4-7H2O; 0,00001 СаСЬ; 0,001 FeSO,,-7H2O.

Пример 3. В перемешиваемом бродильном чане был проведен опыт ферментации с использованием посева Candida lypolytica в дрожжевой азотистой базе (Дифко) с н. Додеканом в качестве углеродистого субстрата и воздухом. Углеродистый субстрат и воздух подавались в бродильный чан непрерывно и раздельно. Температура 30°С, начальное давление воздуха 4 фунт/дюйм (1 фунт/дюйм 0,070307 кгс/см). Когда клеточная плотность достигла 1,0 г/л, давление воздуха было повышено до 15 фунт/дюйм когда клеточная плотность достигла 5,0 г/л, давление воздуха было повышено до 50 фунт/дюйм н поддерживалось таким до конца.

Другой вариант описываемого способа улучшает процесс микробного превращения углеводородов в белок клеток в новой непрерывной многоступенчатой системе ферментации. Растущая биомасса непрерывно подвергается различному давлению питательного газа в каждом бродильном чане, причем в первом чане подвергается самому низшему и в последнем чане самому высокому давлению. Газы, отходящие из чана, рецир.кулируются в одиц или несколько чанов, имеющих меньщую клеточную плотность.

Описываемый способ поясняется чертежом.

Среда, содержащая углеводороды и кислородсодержащий газ, по отдельности или смешанные непрерывно пропускаются через многоступенчатую систему ферментации, содержащую углеводороды, микроорганизмы и питательные вещества. В результате бродильный

чан 1 подвергается самому низшему давлению питательного газа, в бродильном чане 2 давление увеличивается, а бродильный чан 3 подвергается самому высокому давлению, и следовательно, система поддеоживается в постоянных условиях ферментации. Использование питательного газа и скорость производства клеточного белка одновременно максимально увеличиваются в результате Здлиненного временц пребывания субстратов и постепенно увеличивающихся давлений у вытекающего потока, где клеточная плотность и требование на кислород и углерод наивысщие. Свежая или рециркулируемая питательная

среда, питательные газы и клетки могут рециркулироваться в различные чаны ряда и изменяться могут другие параметры, включая объем и геометрию чанов, число их и скорости пропускания свежей среды или жидких сред

в один или более чанов, состав жидкости и питательного газа.

Предмет изобретения

Способ получения биомассы путем выращивания микроорганизмов в водной питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в присутствии минеральных сол-ей при

аэрации кислородсодержащим и углеводародсодержащим газами, регулировании общего парциального давления кислорода и общего давления в питательной среде с последующим отделением микроорганизмов от питательной

среды, отличающийся тем, что, с целью улучшения условий выращивания, регулирование давления кислородсодержащего газа и углеводородсодержащего газа в водной питательной среде осуществляют таким образом,

что оно обеспечивает весовое отношение растворенного кислорода к растворенному углероду в среде до 5-кратного по сравнению со стехиометрическим весовым отношением потребленного кислорода к потребленному углероду

при образовании биомассы, при этом производят одновременное регулирование общего давления газа и общего парциального, давления кислорода, чтобы в среде было менее чем 30 ч/млн общего растворенного кислорода.