Способ получения биомассы микроорганизмов Советский патент 1979 года по МПК C12D13/10 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ танола, предпочтительЕ1о от 20 до 1.00 г/л. В среде также имеются азотсодержащие соединения - такие, как аммиак, аммониевые соли, а также сульфа-ты или хлориды, нитрат, на ftp им ер щелочного металла, или мочевина. Концентрация азотсодержащего соединения кол,еблется в пределах 3-50 г/л. В питательной среде могут, присутствовать также фосфор, сера, магний и железо. В качестве источника фосфора используют фосфаты, например, К2НРО4 , , Na2HPO4, . или ( HPQj. или фосфорную кислоту, концентрация которых находится в пре . 3-20 г/л. Источником серы мржет служить серная кислота или сульфат (КНд)2 ЗОдкониентрацией 0,5-, 5,0 г/л. Металлы присутствуют в виде солей, например, MgSO4-7H2O (концентрация 0,2-2,0 г/л) и Fed-,,- (концентрация 0,01-0,1 г/л). Питательная среда может также содержать следы других элементов в виде солей,, например, кальция, марганца, цинка, кобальта, молибдена, или бора. Примеры питательных сред приве дены в примерах 1 и 4. Процесс можно осуществлять периодически, полунепрерывно или непрерывно. Когда процесс проводят непрерывно, то его можно начать согласно периодической схеме или с использованием более быстрой начальной стадии. При достижении равновесного со.стояния из питательной среды постоянно выводят микроорганизмы, в то время как постоянный объем культуры поддерживают путем постоянного добавления, свежей питагельной среды. В непрерывном процессе концентрацию метанола во вспыливающей жидкости растущей культурыподдерживают на уровне роста независимо от количества метанола в среде, питающей культуры, и эта концентрация должна находиться пр1вдпочтительно на низшем урбвЙе, йё превышающем 0,01% об/об. Микроорганизмы выращивают в бродильном сосуде, например, в аппарате с перемешиванием или с разбрызги вателем, которые снабжают внутренним или вн,ешним охлаждением. Аэрацию культуры осуществляют при помощи во духа, кислорода или обогащенного кис лородом., воз духа . Температуру культуры п.оддерживают 30-50 С, преимущественно 38-45С, рН среды --в пределах 6,01-8,0, предпоч тительно 6,4-7,4, путем добавления щелочи, например, NaOH, КОН, NH.OH, кислоты, например, H2SO, Микроорганизмы извлекают из пита тельной среды одним из стандартных методов, например, флоккуляцией, се диментацией или осаждением с после84дуюпщм центрифугированием или фильтрацией. Биомассу затем высушивают и используют в качестве источника протеина для пищевого сырья для животных и человека./ Пример 1. Выделение смешанных культур. Извлечение смешанных культур 3MS 72 из соответствуюшегр сырья. Пи« тательная среда , используемая в этом методе, обозначается как DCRZ и имеет следующий состав, г/л: 5,0-50,0 Метанол Na2HPO4 КН2Р04 (NH4.)2S04 4,5-9,0 Na-цитрат Na2MoO4 2H О До 1 л рН среды поддерживают 6,8 путем добавления щелочи, например, гидроокиси натрия. Лабораторный бродильный чан (рабочий объем 2,4л) с DCRZ средой при 42°С и рН 6,8 .подвергают взбалтыванию и проводят барботаяг воздухом (2 л/мин). Затем проводят инокуляцию 100 г образца ила, полученного из потока сточной водыиз выпускного отверстия в Sittingbourne, Англия, и дсэбавляют метанол с концентрацией 0,5 об./об. Если наблюдают интенсивное помутнение культуры, добавляют еще метанол (0,5 об./об.). При дальнейшем увеличении помутнения в бродильный чан непрерывно подают DCR2 среду, содержащую 1 об./об. метано-. ла, .при скорости разбавления 0,08 ч. При достижении равновесных условий, определяемых при помощи постоянной величины оптической плотности культуры, скорость разбавления постепенно увеличивают до 0,2 . Таким образом выделяют культуру, обозначенную .ЗМБ 72. Пример 2. Выделение и идей-, тификация типичной смешанной культуpk C3MS.72)j 1 млобразца культуры DMB 72, полученной по способу примера 1, извлекают из бродильного чана, помещают в маленькие стеклянные бутыли и разбавляют питательной средой DCRZ, не содержащей метанол, до концентрации 10, 10 или 10. По 0,1 мл образцов извлекают из бутылей и помещают на агаровые пластинки с пита тельной средой DCRZ и Lab Lemco. Каждую пластинку накрывают колпачком, на который (в случае пластинок с DCRZ) наносят небольшие количества метанола. Пластинки затем перевертывают и термсстатируют при 42С 48 ч. Обследование пластинсэк по истечении этого времени показывает, что только один вид микроорганизмов (обозначенный EN) вырос на пластинках с DCRZ и что четыре вида микроорганизмов (обозначенные MU, FG , 31,, GB) вырастают на пластинках с Ьав Ьегасо. Ис-, пользуя петлю из платиновой проволоки, отдельные колонии каждого микроорганизма переносят на новые пластин ки, содержага ие соответсвующую питательную среду, с целыо получения чистых культур каждого вида..

Таблица 1 386 Пять микроорганизмов, выделенньгх из 3MS 72, подвергают серии испытаний (1-30 в табл. 1) для определения, к какому виду микроорганизмов они относятся. Рез1ультаты испытаний предс авлены в табл. 1, где (+) обозначает положительную реакцию в опыте, а (-) обозначает отрицательную реакцию. На основани1| этихрезультатов четыре микроорганизма классифицируют следующим обр азом: (NCZJB 11019) ; ми Pseudomonas sp. (NC3B 11021); FG Curtobacterium (NC3B 11022); ЛЬ Pseudomonas (NCJB 11020); GR Acinebacter

Окраска по Граму Палочка Палочка Форма Споры Пигмент

Диффузия пигмента

Подвижность

Рост на воздухе

Каталаза

Оксидаза

Глюкоза (кислота)

, Hughu Leifson ;(OF испытание)

Рост на агаре МС Сои Key

Рост напитательном агаре

Рост на бульоне KCN

Зависимость роста оттемпературл,

42

37

5

Рост на метиламине

Гемолиз (кровяной

агар)ровныйсветложелтыйна крахмальномагаре

+ +

ч- +

+ + +

+ +

через 7 дней

Питатель- Питатель.г DCRZ + 0,5%ный агар ный агар : ный метанол.

+

+ +

+ +

+ +/- переменнаяПалочка Палочка Палочка и кокк Серый Желтый

Испытание

- - а Переменный + Слегка -Обесцве- + чивание

-

+ - а +

4-

На основании полученных результатов нельзя классифицировать усваивающий метанол микроорганизм EN (NCZIB № 11040).

+ +

Слегка +

Нет роста

Нет роста

у-слегка- - Нет роста + Нет роста

Слегка + +

Реакцию микроорганизмов на ряд других известных антибиотиков определяют в нескольких опытах. Результаты испытаний представлены в табл. 2.

Таблица 2

S S S S R R S

Сильно S R S

S R

S R

Примечание: S- чувствительный, R - стойкий Пример 3. Опыты с использо ванием усваивающего метанол микроор ганизма EN из 3MS 72. Установка состоит из Н-образной трубки, разделенной на две части ди ализной мембраной, размещенной в го ризонтальной секции трубки. Обе части трубки наполняют 25 мл DCRZ сре ды и 0,2%-ным метанолом. В первой части трубки проводят три отдельных :опыта: i инокуляция микроорганизмов EN; ii) то же; iiiiконтроль - без инокуляции. Во второй части трубки также проводя три опыта: , . i)контроль - без инокуляции; ii) инокуляция смесью не усваивающих метанол микроорганизмов - MU. FG, 32, GR; iii) то же.В каждсм эксперименте получены следующие данные по конечной оптической платности (ОП): Часть II труб ЧастьIтрубки i) on 0 i ,70 ii) ii) on 0,55 iii) on 0,06 iii) Результаты опытов указывают на то, что наибольший рост микроорганиз мов наблюдается, когда EN выращивают в контакте со смесью не усваивающих метанол микроорганизмов MU, FG, dU, GR. Данные также показывают, что вещест о, выделяемое микроорганизмом EN, способно диффундировать через делительную мембрану и поглощаться микроорганизмами ми, FG, JL, GR, i. Чистыеусваивающие метанол микроорганизмы выращивают во взбалтываемой колбе с 500 мл среды DCRZ и 0,1% об./об. метанола, содержащего меченые атомы С . Колбу затем термостатируют при 42°С на ротационном шейкере с орбитальным радиусом 2,5 см при 20°С. Образующуюся двуокись углерода абсорбируют гранулами гидроокиси натрия, помещенньми в трубке, подсоединенной к колбе. Через два дня опт,ическая плотность культуры остается постоянной, что свидетельствует об окончании роста, а в жидкости культуры не остается метанола. Культуру затем центрифугируют при 10 000 об/мин и всплывающую жидкосгь стерильно фильтруют. ii. 100 мл этой всплывающей жидкости инокулиругот 1,0 мд культуры JMS 72, а затем культуру выращивают во взбалтываемой колбе по способу, описанному выше, На каждой стадии (i) и (ii) измеряют радиоактивность, обусловленную присутствием С ; в начале опыта; в образовавшихся микроорганизмах; в всплывающей жидкости в конце; в образовавшемся СО. На стадии (ii) метанол отсутствует и рост микроорганизмов обусловлен ростом не. усв аивающих метанол микроорганизмовв JMS 72. Результаты опытов видны из следующей схемы.

11 Метанол 1,0 г

0,36 г (сух.вее) усваивающих метанол микроорганизмов Общая биомасс Таким образом, рост не усваивающих метанол микроорганизмов способ ствует увеличению общего выхода биомассы. Веществ о , выдел яемоё 5 св айв айЩййй та НОЛ микроорганизмами и необходимое для роста микроорганизмов, не усваивающих метанол, представляет собой углеродный субстрат. Пример 4. Непрерывная культура DMS 72. Семилитровый бродильный сосуд с рабочим объемом 4,2 л загружают DCRZ средой, содержащей 4,0 г/л метанола,, иинокулируют 100 мл культуры DMS 72, которую предварительно термостатируют при 42с в течение одного дня. рН среды поддерживают на

Вышеописанный эксперимент повторяют, используя усваивакяций метанол ми роорганйзм EN и смесь EN с не ус12

671738

Стадия i

0,08 г углерода в

всплывающей жидкости

Стадия ii 0,049 г .(сух,вес)

не усваивающих метанол микроорганизмов

Таблица 3

микроорганизмом приведены в 409 г (сух.вес) . , уровне 6,8, а .температуру - 42с. Культуру перемешивают при 1000 об/мин и аэрируют со скоростью 1 л/ч. Начало брожения проводят по периодической схеме до получения оптическ.ой плотности культуры 1,5 (625 мм). Непрерывную культуру получают .при скорости разбавления от 0,5 доО,6б ч. Равновесное состояние поддерживают, по крайней мере, два дня при каждой скорости разбавления, исключая 0,66 ч Культуру в общем выдерживают 700 ч Коэффициенты выхода биомассы и данные о содержании протеина в биомассе полученной при каждой скорости разбавления, приведены в табл. 3. 72 позволяет также проводить процесс . « „., ... при более высоких скоростях разбавления. Данные о содержании аминокислот в 3MS 72 и EN приведены в табл. 5. Таблица 5

0,06 0,10 0,20 25 5 50 присутствие не усваивающих метанол ;микроорганизмс в в JMS 72 не влияет iсущественно, на содержание аминокислот в -продукте. Пример 5. Соотношение микроорганизмов в CJMS 72 при-получении непрерывной культуры. непрерывную культуру 3MS 72 получают аналогично примеру 2. Во время опыта определение количества бактерий посевом на агар в чашках Петри проводят при каждой скорости разбавления для установления относительных размеров популяций различных микроорганизмов. Образцы культуры, взятые из бро51ильного сосуда, разбавляют стериль.ным солевым раствором (0,85%-ным) до концентрации 0,1 мл х 10 и X 10®и по 0,1 мл разбавленных растворов помещают на высушенные двойные Lam .Lemco пластинки. Пластинки термостатируют при 42°С, а затем подсчитыва-. ют колонии различных типов микроорганизмов.. . Результаты представлены в табл. ,6. Таблица б

15

применяемая в этом опыте, имеет .следующий состав, г/л:

3,000

Na2HP04

3,000 KHjPO 20,000 (NH4)-Sa4

0,750 MgSO4 7H2O FeCl2

0,167 80 Смг/Л) Метанол CaCI Н.О

5,300

Г, 400 гпЗОд 7Н2О

1,300 СаЗОд SHgO

О- 20

Приме следования.

Периодически полученную/культуру микроорганизма выращивают в 2,41 л среды DCRZ, содержащей 1,5% метанола, в -З-литровом лабораторном бродильном сосуде при 42с (без стерилизации после инокуляции). После достижения плотности клеток 3,0 г/л

67173816

Продолжение табл. 6

1,200 1,400 0,800 2,400 До -1 (л) ьный сосуд за ой среды, а гурой 72. /чают концент эк равную

5Концентрацию метанола затем увеличивают ступенчато (приращение 1,0 г/л) до получения концентрации сухого вёса1 леток 25 г/л в .следую42°С, щих условиях опыта: температура

0 pW 6,6 (контролируют КОН), перемешивание при 1500 об/мин, аэрация 51 л/мин, скорость разбавления 0,07- 0,3 Ч-1

Результаты опыта приведены в табл. 7.

Т а б л, и ц а 7

2,0-16,0

0,22

-

чают при скорости разбавления 0,05 ч. В течение двух дней в культуре появляется .споронесущий микроорганизм, и культуру промывают.

В случае испрль.зрвания смешанной культуры JMS 72, споронесущий микроорганизм непоявляется в культуре

300 дней. Да;нные опытов показывают, 17 что смешанная культура имеет большую стойкость к. инфекции, чем чистая культура усваивающего метанол микроорганизма. Непрерывно получают культуры микроорганизма EN 2,41 л среды DCRZ, содержащей 1% метанола, при рН 6,8 и 42° С. Наблюдается пенообразование, достигающее размеров, требующих добавления кремнийосновных противопенных агентов три раза в течение б дне В случ:ае проведения опыта с использованием 3MS 72, введения противопенных агентов не потребуется в те чение 100 дней. Формула изобретения Способ получения биомассы микроорганизмов путем кул ьтивирования бак терий рода Pseudomonas, усваивающих 3818 метанол, в анаэробных условиях на жидкой питательной среде, содержащей метанол, способный к ассимиляции, источник азота и- необходимыеминеральные соли., отличающийся тем, что, с целью увеличения роста микроорганизмов и выхода биомассы, в качестве микроорганизмов, усваивающих метанол, испЪльзуют штамм Pseii domonas NCJB 11040, культивирование которого осуществляют в присутствии штаммов микроорганизмов, не усваивающих метанол: Pseudomonas ЫСЛВ 11019, №11022, Acinetobacter NCJB № 11020 и Curtobacterium NCjB № 11021. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Патент Великобритании 1270006, кл. С 6 F, 1972.