Способ культивирования метанотрофных бактерий Советский патент 1981 года по МПК C12B1/00 

(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МЕТАНОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ

t

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу культивирования метанотрофных бактерия. Биомасса микроорганизмов, потребляющих метан может найти применение в горнодобывающей промышленности для снижения метаноносности угольных пластов.

Известен способ культивирования метанотрофных бактерий Methylocystls или Methylosinus при аэрации на питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и метанол в качестве источника углерода и энергии 1.

Недостатками изве стного способа являются невысокий выход биомассы и и низкая скорость роста микроорганизмов.

Цель изобретення - увеличение выхода биомассы и сокращение времени культивирования.

Указанная цель достигается тем, что в питательную среду дополнительно вводят угольную кислоту. При этом угольную кислоту вводят или в виде бикарбоната натрия в концентрации 0,1-0,25% или в виде углекислого газа до концентрации в газовой фазе 3-10%. В качестве метанотрофных бактерий используют штаммы Methylocystis methanolicus 10 или Methylocystis purvus 57, или Methylocystls minimus 42, или:Methyloc,ystis echinoides 2, или Methylocystis pireformis 14, или Methylosinus trichos- porium 44, или Methylosinus sporium 19.

Указанные виды микроорганизмов

10 сохраняют способность окислять метан после культивирования в среде с метанолом.

Пример. Чистую культуру o(J1ригатных метанокислящих бактерий 5 Methylosinus trichos{3orium штамм 44 выращивают при 30 С, встряхивая на роторной качалке в колбах объемов 0,8 л, содержащих 100 мл жидкой среды слерующего состава, г/л:

20

СНдОН

1,4

NaHCO 2,0 KN03 1,0 1г5 0,75. КН,РО.

25 MggQ. 0.2 0,02 , CaClg. Трилон Б

5 -10

-э FeSO4-7H О 2.10

-4

, 3 -10 -5

30

МпП-. лн-г

ot

2 1 3 2 1 6,8 10-

10

10Фосфаты, метанол и бикарбонат натрия стерилизуют отдельно и вносят в основную среду перед посевом культур Метанол и бикарбонат натрия стери-. лйзумт в стеклянных запаянных ампулах при в течение 1ч.

В контроле Methylosinus trlchoer рогlun штамм 44 культивируют в среде без бикарбоната. Инокулятом служит 3-суточная культура Methylosinus trichpsporlum штамп) 44, выргиценная в среде с метаном. Инокулят вносят из расчета 15 мг сухих клеток бактерий на 1 л среды.,

В ходе опыта, который длится четверо суток, через каждые 10-15 ч оплнгатных метанокисляших бактерий Methylocystis methanolicus, штамм 10 выращивают при 30 С в колбйх мом 0,8 л, содержащих 100 мл среды, указанной в примере 1, но без бикарбоната. Колбы встряхивают на ротор-, ной качалке..

Инокулятом служит 3-суточная культура Methylocystis methanolicus штамм 10, выращенная в среде с метаном. Инокулят вмосят из расчета 0,01 г/л сухих клеток бактерий. Колбы затем герметично закрывают резиновыми пробками с отверстием, в которое вставлен стеклянный кран. Через кран вакуумным насосом откачивают 1/10 часть воздуха из колбы и затем из газометра подают в иее такое же количество углекислого газа, контролируя эту процедуру по показаниям вакууметрЬ. В трех колбах сразу же . посл этого определяют исходную среднюю концентрацию углекислого газа.

ределяют прирост биомассы MethylosiПЦ8 trichosporium штамм 44 и содержание метанола в среде. Биомассу бактерий определяют путем измерения оптической плотности клеточных суспензий на Спектрофотометре Specol с последующим пересчетом прибора по калибровочной кривой на вес сухой биомассы бактерий. Концентрацию метанола в среде определяют на хроматографе Chrom-4 с плеиненноионизационным детектором и стеклянной колонкой 2,5 м X 4 мм, заполненной Porapak Q .

На основании полученных кривых роста и потребления метанола. Methylosinus trichosporium штамм 44 расчитывают параметры роста этой культуры (Х- урожай бактерий, Д) - удельная скорость роста, cj,- удельная активность потребления метанола, У - экономический коэффициент), которые приведены в табл. 1

а б л и ц а 1

В контроле Methylocystis raethanolicus, штамм 10 выращивают при концентргщии углекислого газа, содержащегося в воздухе (0,03%).

/

В ходе опыта, который длится пять суток, через каждые сутки шприцом отбираютПробы (1 мл) суспензии клеток и газа и определяют прирост биомассы Methylocystis methanolicus штамм 10 и концентрацию метанола в среде и углекислого газа в газовой фазе.

50 МЬтоды определения биомассы бактерий, концентрации метанола в среде и расчеты параметров роста Methylocystis methanolicus штамм 10 такие же, как в примере 1. Параметры роста Methylocystis methanolicus штамм 10 в среде с метанолом приведены в табл. 2«

Параметры роста других метанокислящих бактерий на среде с метанолом

Methylocystis

Выращивание метанотрофных бактерий на среде с угольной кислотой позволяет увеличить в.1,5-2 раза скорость роста и 2-5 раз урожай биомассы метанокислящих бактерий в средах, содержащих метанол в качестве источника углерода и энергии. Кроме того, введение углекислоты в состав минеральной среды обеспечивает хороший рост многих метанокислящих бактерий при.таких концентрациях метанола в среде (0,2-0,5), прц которых при отсутствии углекислоты они не развивались.

По сравнению с культивированием в атмосфере метана процесс выращивания биомассы в среде с метанолом является менее опасным и технологически более простым.

Данный способ позволяет получить большие количества биомассы микроорганизмов, сохраняющих способность окислять метан, которая может быть использована для потребления метана в угольных шахтах.

Таблица 2

и бикарбонатом натрия приведены в

табл. 3.

Т а б л и ц а 3

Формула изобретения

7 7701748

мы Methylocystis methanollcus 10 илиИсточники информации,

Methylocystts purvus 57, или Methy-принятые во внимание при экспертизе

locystls minlmus 42, или Methylo-1. Гальченко В.Ф,, Шишкина В.Н.,

cystis echinoides 2, или Methylo-Суэина И.Е. и Троценко Ю.А. Выделеиие

cystis plreformis 14, или Methylo-и свойства новых штаммов облйгатных

cystis trichoaporium 44, или Methy- метанотрофов . Микробиологии, 1977,

losinus aporium 19. 16, 5, 890-897.