Способ получения биомассы микроорганизмов Советский патент 1979 года по МПК C12D13/06 

Изобретение относится к способам получения биомассы микроорганизмов, представляю1цих собой микроорганизмы, которые способны усваивать газообразные органические соединения, содержащие один или более атомов углерода, например метан. Наиболее близким по технической сущности к предложенному способу является способ получения биомассы мик роорганизмов, предусматривающий культивирование в аэробных условиях в при сутствии газообразного метана на жидкой питательной среде, содержащей источники азота и минеральные соли, метаниспользующего микроорганизма в присутствии штамма Pseudomonas NC1B №11112, которые культивируют в присутствии по меньшей мере одного из неметилотрофных микроорганизмов штамма Pseudomonas N С1В 11062, №11063 или №11065 и Mycobacterium N С1В №11061/ при этом температуру культивирования поддерживают в пределах 30-60°С и рН среды 6,0-8,0 1. Недостаток способа состоит в том, что он осуществим лишь при участии всех упомянутых видов микроорганизмов . Преимуществом предлагаемого способа является применение потребляющего метан микроорганизма Methylococcus 999 N С1В №11083 в способе получения одноклеточных протеинов как без, так и с добавлением других микроорганизмов . Цель изобретения - повышение выхода биомассы. Это достигается тем, что в качестве метаниспользующего микроорганизма применяют штамм Methylococcus 999 N С1В №11083, а также тем, что процесс культивирования ведут в присутствии штамма Pseudomonas NC1B №11112 и/или по меньшей мере одного из неметилотрофных микроорганизмов штаммов Pseudomonas N С1В №11062, №11063 или №11065 и Mycobacterium N С1В №11061, при этом в процессе культивирования температуру поддерживают в пределе 30-60С. Сущность способа состоит в том, что для получения биомассы используют как смешанные культуры, полученные следующим путем, так и чистые культуры этого штамма: А. Смешанные культуры, включающие в себя метанпотребляющие микроорганизмы с одним или более видом (штаммом)

метанолпотреблягащих микроорганизмов и одЕшм или более видом (штамг/юм) неметилотрофных микроорганизмов,

В предложенном способе они определены как Т4 и представляют собой следующие культуры Methylococcus 999 N С1В №11083, Pseudomonas N CIB №11112, Mycobacterium N CIB №11061 и три штамма Pseudomonas N CIB №11062, №11063 и №11065.

В. Штамм Methylococcus 999 NCIB №11083 также хорошо растет на метане в присутствии одного или более неметилотрофных микроорганизмов без добавления метанолпотребляющих микроОрганизмов метаболизма штамма Methy- lococcus 999 NCIB №11083.

Если в качестве источника азота используют мочевину, то выращивание штамма Methylococcus 999 ведут в присутствии положительных к уреазе неМетйлотрофных микроорганизмов.

Смешанная культура Т4, выделенная из взятой с фермы тропических уток унавоженной земли, предпочтительна для осуществления способа.

Из смешанной культуры Т4 техникой перекрытых слоев выделяют штамм Methylococcus 999 NCIB W11083 со следующи: 1и характеристиками.

Тип перегородки: и трубчатая перегородка, кокки, диаметр клетки около 0,9 мм, рост при температурах 37, 42 и 55°С и на метаноле.

Сформулированные капсулы.

Цвет колонии: белый/коричневый. Чувствителен с антибиотикам: сульфафуразолу 100 мкг, пенициллину G 1,5 единицы, стрептомицину 10 мкг, тетрациклину 10 мкг и ампициллину 2 мкг.

Характеристика штамма Pseudomonas NCIB №11112.

Характерисзуется способностью к росту и образованию колоний только на агаровых пластинках, содержащих 5 метанол в качестве единственного источника углерода.

Не растет в присутствии глюкозы, лактозы, сахарозы,маннита, инозита/ цитрата или питательного агара. . 0 Размер примерно 2 мк в длину и 1 мк в ширину с одним полярным флагеллумом.

Колонии на агаре - гладкие и серые с целыми краями, образуются на агаровых пластинках с метанолом и минеральными солями порле инкубации в течение 2 дней при .

Характеристика идентифицированных штаммов приведена в табл.1.

Таблица 1

С помощью полярных жгутиков

Продуцирование каталаэы.

Активность оксидазы

Использование глюкозы

Испытания O-F (Хью и Лейфсон).

Стержни

с помощью

полярных

жгутиков

ОкислиОкислительнаятельная

Кислотный фест

Активность уреазы

Использование цитрата

Гидролиз х елатина

Продуцирование индола

Метилкрасный и проба Воже-Проскауэра

Реакции (в килой среде) на

глюкозу сахарозу

маннит мальтозу

Рост на питательной среде

Каталазная активность

Восстановление гидрата Способ получения биомассы осущест ляют предпочтительно при непрерывном культивировании. Для роста микроорганизмы засевают в жидкую питательную среду, которую контактируют с газовой смесью, содер жащей метан и кислород. Метан может быть подан в виде природного газа. Свежую среду непреролвно подают в культуру со скоростью 0,02-1,00 объема в 1 ч и культура выводится с такой скоростью, чтобы объем культуры оставался постоянным. Газ подают в виде пузырьков. Источником кислорода служит воздух, чистый кислород или обогащенный кис(лородом воздух. Отработанный газ отводят из верхней части ферментера, и он может быт замкнут в цикл. Температура культивирования 3060°С, предпочтительно 38-50°С; рН- культуры предпочтительно 6,0-7,0. Клетки микроорганизмов отделяют от культуральной жидкости любым стандартным методом.

Продолжение табл JL

Нет

Слабое

Слабое Биомассу высушивают вымораживанием или распылительной сушкой и используют как протеиновую пищу или пищевую добавку для людей и животных. Пример 1. Непрерывную культуру как смешанной культуры Т4, так и чистой культуры Methylococcus 999 NC1B №11083 выращивают в стерильных условиях в ферментерах с механическим перемешиванием и рабочим объемом 2,5 л. Смесь метана и воздуха в соотнсяиении 2:1 барботируют через жидкость со скоростью 900-1200 мл/мин. Температура культуры при рН 6,8, регулирующемся автоматически добавлением смеси 0,5 NaOH и 0,5 КОН. Культуру перемешивают со скоростью V 200 об/мин. Свежую среду подают и отводят непрерывно, поддерживая постоянный объем. Состав среды в концентрации, ммоль(ЫНч)250ч - 11,0; НзРОч - 10,0; MgSO) - 0,4; CaCIg - 0,1; FeSOg 33 X 10 2пБОц - 1,0 X 10Л MnSO Н,ВО} - 1,0 X CuSOv

1,0 X 10 Ыа,МоОч - 0,2 X KI

0,5 X 10 г- -

0,5 X Н.БОн 1,0 X 10 .

Каждый ферментер засевают 100 мл культуры, выращенной в колбах для встряхивания, один - смешанной кульtypoй Т4, а остальные - чистой культурой Methylococcus 999 NC1B №11083,

Т4

0,34

Пример 2. Культивируют штамм Methylococcus 999 (один) и смесь этого штамма с поло жительными к мочевине бактериями, не способными к росту на метане, но способными к росту на веществах, производимых микроорганизмом Methylococcus 999.

Культивирование ведут при 42°С в солевой среде в стерильных стеклянных сосудах емкостью 500 мл.

Иетан, воздух и углекислый газ Пропускают со скоростью 25, 100 и 10 мл соответственно через фильтр из спеченного стекла.

Methylococcus 999 (чистая)

Methyiococtus 999 (смешанная с положительными к уреазе бактериями)

Положительные к мочевине бактерии характеризуются следующим образом грамм штамм +, форма - палочки, неподвижные, рост на воздухе +, кат.алазе +, оксидазе -, кислой глюкозе (газ) +, OF (Hugh and Zeifson) +, уреазе +, нет денитрификации.

Результаты показывают, что Methylococcus 999 NC1B 11083 хорошо растет только на мочевине, если присутствуют положительные к уреазе микроорганизмы.

Среду подают в ферментеры в интервале скоростей разбавления 0,100,2-0,3 тех пор, .пока культура не начнет вымываться из сосуда.

Установившееся состояние поддерживают для каждой скорости разбавления по крайней мере в течение 48 ч.

Полученные результаты приведены в табл.2..

Таблица 2

0,71

2,42

Колбы инокулируют 1,5мл свежего 5 инокулума. Среда следующего состава, г/л: КНаРОч - 1,6; - 1,16, {NH3)aCO - 2,0; MgSOi(-7HjO - 0,08; FeSOi, 7НзО - 0,014; 3.( 0,025; CuS04-5HgO - ZnSOi/-7H,O3,4 MnSO;. - 3 lO; Ыа МоОц-2НаО - 2,4-10.

Количество среды 300 мл.

Рост Methylococcus 999 NCIB №11083 и смешанной культуры оценивают путем измерения оптической плотности при 625 нм {значения величины для одной из трех культур).

Полученные результаты приведены в табл.3.

ТаблицаЗ

0,005 0,005 0,029 0,054

0,005 0,229 0,490 0,550

Пример 3. Смешанную культуру Т4 выращивают на различных источниках азота в различных условиях.

Культивирование ведут аналогично примеру 1. Условия культивирования температура 42°С, рН 7,0, скорость разбавления 0,18 ч, скорость перемешивания 100 об/мин, общая скорость потока газа 600 мл/мин.

Выход рассчитывают по анализу газового потока на входе и выходе из ферментера с помощью газовой хроматографии и с учетом измерения скорости потока газа. Определяют концентрацию сухой массы микроорганизмов, которая находится между 4 и 5 г/л, по разнице концентрации углерода между образцом культуры и культурой, всплывшей после центрифугирования образца 6000 г в течение 15 мин.

Содержание углерода в клетках, высушенных в сушильных шкафах, равно 48%,

Использованная среда содержит, г/л: KHjPO - 1,60; - 1,16; MqSO4-7H O - 0,080; FeSOi 7Н2О Подаваемое соотношение

воздух/метан в газе 3:1 6;1 .3:1 6:1

Предельный фактор

ростаО, СН, О, СНч

0,014; Ca(NOj). - 0,025; CuSO(v5HjO - 2,4-10- ; ZnS04-7H O 3,4-10-; - 3,0-10- ; КаМоОч-2Н О - 2,410; CoCI;. 1,5 -10-.

Добавляют концентрированную серную кислоту (36 н.) в количестве 0,33 мл/л.

В качестве источника азота добавляют 3,18 г/л NaNO3, 2,46 г/л (NH;,)2SO4 или 1,122 г/л (NH2)2CO.

Влияние источника азота и предельного фактора на непрерывное культи1вирование смеси Т4 показано в табл.4 Таблиц а 4

3:1 тивирование метаниспользующего микро организма в аэробных условиях в присутствии газообразного метана в жидкой питательной среде, содержащей источники усвояемого азота и необходимые минеральные соли, отличающийся тем, что с целью увеличения выхода биомассы, в качестве ме таниспользующего микроорганизма применяют штамм Methylococcus 999 NC1B №11083. 2. Способ по п.. I, отличающ и и с я тем, что процесс культивирования ведут в присутствии штамма 6 12 Pseudomonas NC1B №11112 и/или по мень шей мере одного из неметилотрофных микроорганизмов штаммов Pseudomonas NC1B №11062 или №11065 и Mycobacte- , rilum NCIB №11061. 3. Способ по п.1 или 2, о т л и - чающийся тем, что в процессе культивирования температуру поддерживают в пределе 30-60 С. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Заявка №2090249/13, кл. С 12 D 13/06, 1974, по которой принято решение о выдаче патента.