Способ определения содержания экзогенного субстрата в питательной среде и устройство для его осуществления Советский патент 1978 года по МПК G01N33/16 

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в различных отраслях народного хозяйства, связанных с выращиванием микроорганизмов, предпочтительно дрожжей.

Известен способ определения содержания экзогенного субстрата в питательной среде, предусматривающий экстракцию субстрата из суспензии микроорганизмов растворителями с последующим спектрофотометрированием полученного экстракта в определяемой области спектра 1, 2.

При определении субстрата из суспензии известными спирт-гексановым 1 и инфракрасным 2 спектрофотометрическим методами, основанными на экстракции субстрата из суспензии микроорганизмов соответственно спирт-гексановой смесью и четыреххлористым углеродом, фотометрирование проводят в инфракрасной области спектра.

Однако известные способы позволяют проводить определение субстрата только дискретно, путем экстракции из суспензии микроорганизмов различными токсичными растворителями без учета физиологического состояния популяции микроорганизмов.

. Известен также способ определения содержания экзогенного субстрата в питательной среде при непрерывном культивировании микроорганизмов.

Известно устройство для осуществления указанного способа определения содержания экзогенного субстрата в питательной среде, содержащее измерительную и сравнительную камеры для анализируемой питательной среды, источник света, двухлучевую осветительную систему, обтюратор, фильтры возбуждения и люминесценции и фоторегистрирующую систему с фотоумножителем 3.

Этот известный способ и устройство для его осуществления являются наиболее близкими к описываемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату.

Указанный способ не позволяет получать непрерывную информацию о физиологически необходимом содержании экзогенного субстрата в непрозрачной водной суспензии микроорганизмов по оксидоредукционным изменениям одного из компонентов дыхательной цепи митохондрий, а известное устройство для осуществления этого способа не обеспечивает получения непрерывной информации о характере исследуемой среды и не может быть использовано в непрерывном технологическом процессе, что в свою очередь не обеспечивает достаточно высокой производительности процесса культивирования и высокое качество биомассы. Целью изобретения является повышение производительности процесса культивирования и улучшение качества биомассы. Поставленная цель достигается тем, что согласно предлагаемому способу определения содержания экзогенного субстрата в питательной среде при непрерывном культивировании микроорганизмов, предпочтительно дрожжей, исходную суспензию микроopгaн змoв облучают монохроматическим светом в интервале длин волн 330-370 нм и одновременно измеряют разность интенсивности люминесценции окисленной и восстановленной форм никотинамидадениндинуклеотида (НАД), содержащегося в клетках микроорганизмов, и в зависимости от получаемой величины по градуировочно.му графику определяют физиологически необходимое количество субстрата, вводимого в питательную среду при данной степени аэрации. При этом устройство для осуществления предлагаемого способа снабжено емкостью с барботирующи.м приспособлением и подводящими трубопроводами для ввода анализируемой питательной среды и окислителя, а также отводящими трубопроводами, один из которых сообщает емкость со сравнительной камерой, а два других осуществляют слив отработанной суспензии, при этом измерительная камера соединена подводящим трубопроводом с источником снабжения анализируемой среды. Кроме того, для повышения точности измерений измерительная и сравнительная камеры, фотоумножитель, а также фильтры осветительной и фоторегистрирующей систем размещены на интегрирующей сфере. На фиг. 1 изображена схема устройства для осуществления способа определения содержания экзогенного субстрата в питательной среде; на фиг. 2 -график зависимости между содержанием . парафина в среде (СПЗР) и величиной разности интенсивности флуоресценции восстановленной и окисленной формы НАД-(Д1). Устройство для осуществления предлагаемого способа (фиг. 1) содержит источник 1 света (ртутно-кварцевую ламп, двухлучевую осветительную систему 2, обтюратор 3, а также фильтр 4 возбуждения, измерительную и сравнительную камеры 5 и 6 и фильтр 7 люминесценции, размещенные на интегрирующей сфере 8, и фоторегистрирующую систему. Фоторегистрирующая система содержит фотоумножитель 9, усилитель 10, синхронный детектор 11, диффс;ренц.иа.пьный усилитель 12 и регистрирующий прибор 13. В устройстве имеется емкость 14 с барботирующим приспособлением 15, подво-. дящие трубопроводы 16 и 17 для ввода анализируемой питательной среды и окислителя, а также отводящие трубопроводы 18, 19. Отводящий трубопровод 18 сообщает емкость со сравнительной камерой 6, а отводящие трубопроводы 19 осуществляют слив отработанной суспензии. Измерительная камера 5 соединена подводящим трубопроводом 20 с источником снабжения анализируемой среды (на чертеже не показан). При определении экзогенного субстрата в питательной среде с помощью указанного устройства исходную суспензию дрожжей из ферментера пропускают через проточные светоизолированные измерительную и сравнительную камеры 5 и 6, причем перед подачей суспензии в сравнительную камеру 6 ее пропускают через емкость 14, где осуществляют ее барботаж окислителем (кислородом воздуха) для полного окисления внутриклеточного НАД. С помощью двухлучевой оптической системы 2 формируют два световых .модулированных монохроматических потока возбуждающего излучения, которыми поочередно облучают камеры 5 и 6. Возникающие при этом световые импульсы, обусловленные люминесценцией среды, воспринимаются фотоумножителем 9, расположенным в отверстии сферы 8 перпендикулярно направлению возбуждающего излучения. Узкополосный фильтр 7 выделяет вторичное излучение - люминесценцию на заданной длине волны в интервале 430-470 нм, фотоумножитель 9 при этом регистрирует монохроматическое излучение один раз от измерительной камеры 5 и второй раз от сравнительной 6. Последовательность импульсов усиливается усилителем 10 и поступает на вход синхронного детектора И, который обеспечивает разделение сигналов лю.минесценции от двух камер и преобразование их в уровни напряжения, соответственно пропорциональные этим сигналам. Два уровня напряжения поступают на вход диф- ференциального усилителя 12. Сигнал на его выходе пропорционален разности этих двух уровней или же разности люминесценции от двух ка.мер 5 и 6, и регистрируюп1ий прибор 13 обеспечивает непрерывную запись этого сигнала. При выращивании дрожжей рода Candida guiliermondii исследуют влияние различных концентраций экзогенного субстрата-п.арафина на изменение разности интенсивности флуоресценции восстановленной и окисленной форм НАД. Дрожжи выращивают в 30 л ферментере при температуре 32- 34°С. и рН 4,0-4,2 на синтетической среде, содержащей в качестве единственного источника углерода парафины, а в качестве источника калия,- магния, цинка, марганца, железа, фосфора - их минеральные соли при степени аэрации 1200 об/мин мешалки. Концентрацию парафина в среде изменяют в диапазоне от 8 до 0,1 г/л. Контроль за содержанием

парафина в среде осуществляют спектрофотометрическим методом. По результатам полученных испытаний строят график (фиг. 2).

Как видно на графике, существует обратно пропорциональная зависимость между содержанием парафина в среде (Спар) и величиной разности интенсивности флуоресценции восстановленной и окисленной форм НАД (Л I ). Следует также, что при уве.щчении конце}гграции парафина выше 6 г/л при данной степени аэрации дрожжи не могут окислить полностью субстрат, что приводит к накоплению его в клетках микроорганизмов и ухудшению качества продукта с одновременным снижением скорости роста микроорганизмов. Предварительно построенный градуировочный график обеспечивает определение физиологически необходимого количества субстрата в суспензии следующим образом. Суспензию микрооргаиизмов с концентрацией сухих веществ не выше 25 г/л наливают в измерительную кювету, которую помещают в светоизолированную ка.меру прибора, облучают с помощью ртутной лампы монохроматическим светом и измеряют интенсивность флуоресценции в области 430-470 нм. Во вторую сравнительную камеру номендают такую же суспензию, но предварительно нробарботированную,которую также облучают монохроматическим светом и из.меряют интенсивность флуоресценции в области 430-470 нм. При этом следует следить, чтобы суспензия не расслаивалась. Построив график зависи.мости А, ., определяют участок, где клетки могут потреблять добавляемый субстрат, и уровень насыщения, т. е. количество субстрата, физисхтогически необходимое и достаточное для нормального метаболизма K.ieTOK. По показаниям регистрирующего прибора и абсолютно сухому весу микроорганизмов в-суспензии определяют нормированную величину интенсивности флуоресценции НАД, но которой с помощью калибровочного графика определяют физиологически необходимое содержание субстрата в среде.

При этом разность люминесценции восстановленного (измерительная камера) и окисленного (сравнительная камера) никоти нами.даденнндинуклеотида составляет 4,5 мв нрн концентрации абсолютно сухих дрожжей 15 r/j,. Ве.1ичина интенсивности люминесценции в пересчете иа единицу абсолютно сухих дрожжей равна 0,3 мв на 1 г/л относительных единицах).

С помощью калибровочной шкалы регист.рирующего прибора определяют концентрацию субстрата в среде, которая равна для данного конкретного случая 0,8 г/л. Согласно калибровочному графику данная концентрация ниже функционально необходимой для клеток, поэтому для оптимального

ведения процесса биосинтеза содержание парафина в среде надо увеличить до 6 г/л (см. фиг. 1), что соответствует максимальным физиологическим потребностям клетки. Таким образом, предлагаемый способ определения физиологически необходимого содержания экзогенного субстрата и устройство для его реализации позволяют не только быстро и с достаточной точностью (до ±5%) контролировать содержание субстрата в среде, но и с учетом физиологического состояния популяции микроорганизмов, определяемого по оксидоредукционны.м изменениям внутриклеточного фермента НАД, регу.пировать в зависимости от степени аэрации содержание субстрата в среде, необходимое для обеспечения максимальной скорости роста микроорганизмов и улучшения качества продуктов, т. е. предлагаемый способ и устройство позволяют вести процесс в оптимальных условиях.

Технико-экономический эффект при использовании предлагаемого способа и устройства для его выполнения создается благодаря ведению процесса при оптимальных условиях с получением продукта высокого качества, экономии сырья и точного и объективного измерения содержания субстрата

В суспензии микроорганизмов.

Формула изобретения

1. Способ определения содержаиия экзогенного субстрата в питательной среде при непрерывном культивировании микроорганизмов, предпочтительно дрожжей, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности процесса культивирования н

улучшения качества биомассы, исходную суспензию микроорганизмов облучают монохроматическим светом в интервале длин волн 330-370 нм и одновременно измеряют разность интенсивностей люминесценции

окисленной и восстановленной форм никотинамидадениндинуклеотида, содержагцегося в клетках микроорганизмов, и в зависимости от нолученной величины по градуировочному графику определяют физиологически необходимое количество субстрата, вводимого

в питательную среду при данной степени аэрации.

2. Устройство для осуществления способа по п. 1, содержащее измерительную и сравнительную камеры для анализирования

питательной среды, источник света, двух.мучевую осветительную систему, обтюратор, фильтры возбуждения и люминесценции и фоторегистрирующую систему с фотоумножителем, отличающееся тем, что оно снабжено емкостью с барботирующим приснособ.лением и подводящими трубопроводами для ввода анализируемой питательной среды и окислителя, а также отводящими трубопроводами, один из которых сообщает емкость со сравнительной камерой, а два других осущест вляют слив отработанной суспензии, при этом измерительная камера соединена подводящим трубопроводом с источником снабжения анализируемой среды.

3. Устройство по п. 2, отличающееся тем, что с целью повыщения точности изме з,01пн.ед 0,5 o, 0,3рении, измерительная и сравнительная камеры, фотоумножитель, а также фильтры осветительной и фоторегистрирующей систем размещены на интегрирующей сфере.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Санин П. И., Ципугина Н. Н., Сучкова А. А., Сущик Р. Я. «Микробиологическая промышленность, № 1, 1972, с. 38-40.

2.Андреев Н. С., Сидорова И. П., Найдин А. В . «Микробиологическая промышленность, № 4 1976, с. 14-17.

3.Патент США № 3249754, кл. 250-83.3, 1966.

fS

PU2.1