Способ определения дыхательной активности микроорганизмов Советский патент 1987 года по МПК C12Q1/02 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к биотехнологическим процессам производства различных бактерийных препаратов и продуктов микробиологического синтеза.

Цель изобретения - увеличение чувствительности определения.

Способ определения дыхательной активности культур микроорганизмов за- ключается в следующем.

В кварцевую кювету помещают иссле- дуемьпЧ образец культуральной суспензии. В образец вносят порцию кислорода в виде определенного объема физио- логического раствора, в который предварительно добавляют определенньЕЙ объем индикаторного раствора, приготовленного путем специальной обработки из суспензии клеток микроорганиз- мов, выраженных при определенных условиях, обеспечивающих накопление значительных количеств внутриклеточных веществ цинкопорфириновой природы.

Измеряют время от момента внесения в исследуемый образец культуры микроорганизма указанного раствора до момента полного восстановления ин тенсивности свечения индикаторной культуры до с гацио 1арного значения. Концентрация остаточного кислорода в суспензии в этом случае меньще 10 М

В качестве индикаторного раствора содержащего вещества, обладающие способностью к замедленной флуоресценции, которая тушится растворенным в среде кислородом, используют пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisial, выращенные предварительно в условиях обеспечивающих накопление в клетках высоких пулов соединена цинкопорфириновой природы.

Методика приготовления индикатор- ной культуры заключается в следующем

Культуру промышленного щтамма Sac charomyces cerevisial выращивают на стандартной синтетической питательно среде следующего состава, г: 12} 200,5

,0,5

NaCl5,0

MgS04, , 138

12Н..,01 ,35

, 1,8

Лимоннокислый аммоний4, 5

Сахароза50,0

ZnS()4- ,0029

(концентрация подобраназкспери- ментально и является оптимальнойдля накоплениядлительн люминес- цирующих соединений) .

Выращивание проводят при без принудительной аэрации в колбах в течение 72 ч.

По окончании процесса культивирования проводят контрольное измерение уровня интенсивности замедленной флуоресценции с целью оценки концентрации синтезированных цинкопорфирино вьгх соединений. Вычисляют удельную концентрацию флуорофора на единицу биомассы.

Культуральную суспензию дрожжевых клеток инактивируют посредством термической обработки при 80°С в течение 20-25 мин. Проводят повторный контроль характеристик замедленной флуоресценции дрожжевой культуры. Свечение должно полностью отсутствовать. Это объясняется тем, что при указанных условиях термической обработки инактивируется эндогенное клеточное дыхание и растворенньш в среде кислород тущит замедленную флуоресценцию клеточных цинкопорфиринов. Полученную инактивированную культуру центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин и ресуспендируют в физиологическом растворе до конечной концентрации 100 г/л.

Индикаторную культуру хранят в плотно закрытом сосуде при пониженно температуре (+4°С) в течение шести месяцев в условиях, не требующих стерильности.

Перед измерением дыхательной ак- TtffiHocTH исследуемой культуры микроорганизма индикаторную суспензию разводят физиологическим раствором до концентрации 5 г/л. Температуру индикаторного раствора доводят до темпе i

ратуры исследуемого образца культуры При проведении измерений необходимо, чтобы концентрация индикаторного флуорофора в смеси оставалась постоянной. Как показали предварительные исследования, обычно при одном измерении требуется 1 мл анализируемой культуры и 1 мл индикаторного раствора.

Предлагаемый способ измерения дыхательной активности микроорганизмов основан на том, что активная анализируемая культура утилизирует внесенную порцию кислорода. При снижении концентрации растворенного кислорода в смеси до уровня 10 М и ниже устраняется эффект(Тушения кислородом замедленной флуоресценции цинкопорфири нов индикаторной культуры. Способ позволяет контролировать скорость потребления кислорода анализируемой культурой на основании измерения динамики восстановления интенсивности замедленной флуоресценции индикатор- ной культуры, активности культур микроорганизмов, не обладающих собственной замедленной флуоресценцией, например, для измерения скорости потребления кислорода культурой Esche- richia coli М-17 при производстве лечебно-профилактического препарата ко- либактерина, культурой Baccillus sub- tilis (продуцента рибофлавина), культурой Brevibacterium flavum (продуцента гомосерина).

Пример 1. Культура Escheri- chia coli М-17. Среда для культивирования - М9. Источник углерода и энергии - глюкоза 0,3% . Периодичес- кое выращивание в ферментере рабочим объемом 2 л. Скорость аэрации 1 л/1 среды в минуту. Скорость вращения мешалки 900 об/мин.

В процессе выращивания отбирают пробы культуральной ; идкости (0,1- 1,0 мл в зависимости от дыхательной активности популяции ) и помещают в кварцевую кювету. Туда же вносят О,1 мл индикаторной суспензии и на- слаивают тонкий слой технического жидкого масла. Суспензию облучают видимым светом с помощью галогенной лампы. Приемником излучения служит ФЭУ. Флуоресцентный сигнал усиливает- ся микровольтметром и регистрируется на ленте самописца. Регистрируется длительная люминесценция с временем жизни 2-10 . По наличию флуоресцен

0

5 0 5 0

0

5

5

40

гного сигнала судят об отсутствии растворенного кислорода в образце и к анализу приступают после появления сигнала. Вводят в образец порц1по физиологического раствора (0,1-1,0 мл а зависимости от активности дыхания микробных клеток). Регистрируют время от момента введения в образец порции растворенного в физиологическом растворе кислорода до момента выхода на стационарньй уровень сигнала длительной люминесценции веществ индикаторных клеток.

На-фиг.1 представлены результаты измерения величин концентрации биомассы (1), скорости потребления растворенного кислорода культурой E.coli М-17 в процессе культивирования предлагаемым способом (2). Для сравнения приведены результаты измерения дыхательной активности популяции с использованием газового анализатора (3). Минимальная чувствительность газового анализатора (0,5%) не позволяет измерять величину скорости потребления кислорода менее, чем 0,2 г л ч (фиг.2) при используемом режиме аэрации и перемещивания. Б то же время предлагаемый способ позволяет при этих условиях регистрировать указанную величину до значений 0,001 г л .

В течение всего 10-часового процесса культивирования не было отмечено наличия длительной люминесценции у самих живых клеток E.coli М-17, что не позволяет использовать для тестирования дыхательной активности данной популяции известньй способ.

Пример 2. Культура E.coli М-17. Среда для культивирования - мя- сопептонный бульон. Источник углерода и энергии - глюкоза (1%). Культивирование в ферментере с рабочим объемом 30 л с целью производства лечебно- профилактического препарата колибак- терина. Условия аэрации и перемешивания, а также процедура измерения дыхательной активности бактериальной суспензии аналогичны изложенным в-, примере 1.

В табл.1 представлены результаты измерения скорости потребления кислорода популяцией E.coli М-17 в процессе культивирования предлагаемым и известным способами.

Накопление длительно люминесцирую- щих соединений в самих живых клетках кишечной палочки при исследованном

регламенте выращивания отмечается лишь к концу процесса (6-7 ч). Следовательно, использование известного метода измерения дыхательной активности микроорганизмов на протяжении большей части процесса культивирования E.coli М-17 невозможно. Применение предлагаемого способа позволяет контролировать скорость потребления кислорода данной микробной популяцией на протяжении всего процесса выращивания.

Пример 3. Культура Bacillus

subtilis 304-23, .генетически изменен- 15 ляции в процессе периодического кульный штамм - продуцент рибофлавина. Среда для культивирования - селективная среда СпицаГ зена. Ферментер объемом 2 л. Условия аэрации и перемешивания, а также процедура измерения дыхательной активности микроорганизма аналогичны примеру 1.

На фиг.З представлены результаты измерения дыхательной активности популяции Вас. subtil is в процессе периодического культивирования предлагаемым способом. Обнаружено, что на протяжении всего исследуемого процесса клетки Вас. subtilis не содержат длительно люминесцирующих соединений цинкопорфириновой природы, что делает невозможным использование известного способа. Применение предлагаемого способа позволяет производить ; оценку скорости потребления растворенного кислорода популяцией Вас. subtilis на протяжении всего процесса :выращивания.

Пример 4. Культура Micrococ CUS glutamicus 95, генетически измененный штамм - продуцент лизина. Состав среды для культивирования (содержание компонентов среды в 1 л) 2,: фосфорнокисльп аммоний 2; сернокислый аммоний 2; сернокисльп магний 0,5; сернокислый марганец 0,04; меласса 30; кукурузньо экстракт 5.

Процедура выращивания штамма и измерения дыхательной активности клеток аналогичны примеру 1.

На фиг.4 представлены результаты измерения в процессе выращивания М. glutamicus 95 скорости потребления растворенного кислорода микробными клетками предлагаемым способом. Результаты проведенных исследований показали необходимость использования известного способа для контролирования дыхательной активности популяции

391306

ввиду отсутствия в клетках исследуемого микроорганизма на протяжении всего процесса выращивания замедленно флуоресцирующих соединений цин- копорфириновой природы.

Пример 5. Культура Brevibac- terium flavum 2Т, генетически измененный штамм - продуцент гомосерина. 1Q Условия культивирования и измерения дыхательной активности клеток аналогичны примеру 4.

На фиг.5 изображена динамика дыхательной активности исследуемой попу0

5

0

5

0

5

0

5

тивирования. Измерения проводились предлагаемым методом. Не отмечено накопление в клетках исследуемого микроорганизма собственных замедленно флуоресцирующих веществ цинкопорфириновой природы. Следовательно, использование известного способа для измерения скорости потребления кислорода микробными клетками в исследуемом технологическом процессе невозможно.

Таким образом, способ контроля дыхательной активности микроорганизмов обеспечивает проведение измерений скорости потребления растворенного кислорода микробными модуляциями, в клетках которых не содержится собственных замедленно флуоресцирующих соединенш, изменяющих параметры своего свечения в зависимости от содержания растворенного кислорода в культуральной жидкости.

Динамический диапазон измеряемых предлагаемым способом скоростей потребления кислорода обеспечивает на- дежньй контроль за дыхательной активностью микробных популяций на протяжении всего процесса выращивания перечисленных видов микроорганизмов.

Формула изобретения

Способ определения дыхательной активности микроорганизмов путем выращивания их на питательной среде, отбора Исследуемой пробы суспензии, облучения ее светом с последующей регистрацией длительной люминесценции и введением в пробу порции кислорода, растворенного в физиологическом растворе, измерения времени от момента окончания аэрации до восстановления свечения по величине, которой оценивают дыхательную активность культуры, а скорость потребления растворе н 13391

ного кислорода клетками исследуемого микроорганизма определяют по результатам измерения времени от момента

окончания аэрации до восстановления

ь

свечения длительно люминесцирующих соединений, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности определения в отобранную пробу культуральной жидкости вносят ю

Спосов

Значения скорости, г/л-ч, ратличнис | 1 ем«нмые кктгрвалы ч)от начала лроцрсса культивирование

ZlllllirilZ

Известный ---.,,112,95гО,11

; i:::Eii::i; i;iii:::j: :;z :

Првдлагае й0.0710,01О, .0Гil.luiO.lO ,03 2.П10,Ов 2,91:0,103,3110,123,OOlO, П

8

индикатор, в качестве которого используют суспензию пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisial, полученную путем культивирования, до накопления в клетках цинкопорфиринов, обеспечивающих люминесценцию 10 -10 - с и инактивированную при в течение 20-25 мин с последующей отмывкой до концентрации 4-5 г/л.

т б л N ц и I

7,5 Ki,2/.v

Изобретение относится к микробиологии, а именно к биотехнологическим процессам производства различных бактерийньк препаратов и продуктов микробиологического синтеза. Целью изобретения является увеличение чувствительности определения. Способ определения дыхательной активности культур микроорганизмов заключается в том, что к исследуемым микробным клеткам добавляют индикатор, в качестве которого используют суспензию пекарских дрожжей Saccharomyces сеге- visial, полученную путем культивирования на среде до накопления в клетках цинкопорфиринов, обеспечивающих люминесценцию 10 -10 с и инактиви- рованную при в течение 20-25 мин с последующей отмывкой до концентрации 4-5 г/л. Измеряют время от момента внесения в исследуемый образец культуры микроорганизма до момента полного восстановления интенсивности свечения индикаторной культуры до стационарного значения, по величине которого оценивают дыхательную активность культуры. 5 ил., 1 табл. § (Л со 00 со со

УО..Г.

б

12 16 го 2 zs зг ,«

Фи1.3

8

7624-32

Фиг.

0

8 f.v

/

,

-f- -I1-:1 -

гб г зг ив ss s фиг. 5

Редактор А.Шишкина

Составитель Л.Борисова Техред М.Дндык

Заказ 4183/17 Тираж 499Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Произволен иемно-полиграфбческое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

/

к-

N

ss s

71 /V

Корректор И.Эрдейи