Способ получения агрегата микробных клеток Советский патент 1978 года по МПК C12D13/10 

Г

Изобретение касается энэиматического процесса с применением иммобилизированных мнкробньрс клеток, а и сенно способа получения агрегата микробных клеток.

Микробные клетки, имеющие связанные с ними активные энзимы, флоккулируются в присутствии некоторых металлических соединений и образуют стабильные, соц.вржашие клетки, агрегаты. Согласно «звестному способу получения указанных агрегатов осутествпяхуг культивирование микроорганизмов в жидкой питательной среде, вводят фпрккулянт, в качестве которого лспользуют, например, Примафлок, G-7f А-1О, отделяют полученные агрегаты от культуральной жидкости, осу1иествл$1ют экструзию флоккулированных клеток, а затем их cyai&T .

Однако полученные данным способом агрегаты микробных клеток недостаточно твердые и стойкие. С течением времени имеет место потеря их энзиматической активности.

С целью увеличения твердости и стабильности агрегатов клеток согласно предлагаемому способу перед введением фпок- кулянта, в культуральную жидкость добавляют окись или гидроокись иЛи. фосфат или сульфат магния или кальция или железа или марганца.

При этом для культивирования из микроорганизмов яспопьзуют микроорганизмы рода A thh-oba cteK .

Таким образом в описываемом способе предусмотрены приемы, обеспечивающие стабильность агрегатов флоккулированных клеток, в связи с чем они проявляют большую стойкость против уплотнения в процессе культивирования.

Улучшение стабильности агрегатов клеток способствует также значительному увеличению скорости течения растворов субстрата через их спой, что в свою очвредь делает возможным вести переработку растворов сравнительно высокой вяэ кости.

Пример. В результате культивирования микробиологической культуры Afthrobaoter К Ь В-3728, на питательной среде получают культуральную ЖИДКОСТЬ, от которой отбирают порцию в 19 л и вводят в нее л 1%-ного раствора Примафлок С-7 (рН которого предварительно доводят от 5), затем Е,в дят 7,7 л 1%-ного раствора. Примафлок А-10 (рН которого предварительно доведен до 7), Примафлок С-7 и А-10 являются катио ным и анионным флоккулянтами, поставлен ными фирмой Ром и Хаас, Филадельфия. После добавления флоккулянтов раствор перемешивают 5 минут и флоккулированны клетки отделяют фильтрованием. Влажные агрегаты флоккулированных клеток экструдируют и экструдат высушивают при в шкафу с принудительной тягой в течение 18 часов. Высушенный материал- размалывают Просеивают, отбирают частицы крупностью мкм. Определяют активность изо- меразы глюкозы эти.х частиц. Она составила 62,7 миллиединиц/грамм. Берут вторую порцию культуральной жидкости и объемом 1 л перемешивают с 6О г окиси магния до увеличения рН от 5,7 до 8,5, Дальнейшую обработку этой смеси ведут аналогично описанному выше. Отделяют агрегаты крупностью 1626 меш и определяют активность изомера зы их. Она равна 52,1 миллиединиц-грамм Для проверки твердости агрегатов клеток и определения эффективности описываемого ме1ода применяют прибор для измерени твердости иСопротивления сжатию полученных частиц. Подлежащие испытанию агрегаты помещают между пластинами прибора, одна из которых выполнена с возможностью перемещения с аадан Шй скоростью в направлении неподвижной пластины. Этим прибором можно измерить усилие, необходимое для сжатия агрегатов до заданной толщины, например до О,381 мм, т. е. подвижная пластина не доходит до неподвижной на 0,38 мм. Было установлено, что скорости течения растворов субстрата через слой флок купированных клеток становятся более стабильными и не уменьшаются по мере увеличения сопротивления сжатию агрегатов флоккулированньк клеток. Для определения твердости высушенных агрегатов флоккулированньк клеток (размером меш) ах погружают в воду при комнатной температуре на 4 часа (для набухания). Затем воду заменяют рав ным объемом 2М раствора глюкозы срН8,0 Для этого частиды из воды переносят в этот раствор и выдерживают в нем в те чение ночи, имитируя тем самым , Э которых агрегаты находятся при изомеризации глюкозы. Затем из числа погруженньк в раствор глюкозы агрегатов берут 10 и промокательной бумагой удаляют с них раствор, после чего помещают в центре пластин (между ними), чтобы агрегаты не соприкасались между собой, и определяют величину сопротивления сжатию агрегатов. При этом получают, что на сжатие агрегатов клеток, полученных по предлагаемому способу (с добавлением окиси магния) требуется усилие в 9,5 кг, а на сжатие контрольных - 3,3 кг. Для определения скоростей течения субстрата через слой агрегатов флоккулированных частиц была проведена их оценка в условиях непрерывной работьц Для этого 75 г высушенных частиц размером 16-20 меш, полученных при осуществлении предлагаемого способа и контрольным приемом, было погружено в воду на некоторое время для набухания. Затем материал был промыт 8л О,ОО4М раствора .хлористого магния, содержащего 0,1 М раствор бикарбоната натрия в качестве буфера. Промытые частицы в каждом случае загружали в снабженные рубашкой колонки диаметром 1 дюйм, нагреваемые до 6О С. Через колонки самотеком пропускали 50%-ный по весу раствор глюкозы, и.определяли скорости течения его. Результаты, приведенные в таблице 1, показьюают, что флоккулированные клетки, содержащие добавленную окись магния, обнаруживают более замедленное уменьшение скорости течения раствора глюкозы, чем необработанные (контрольные). Было найдено, что кроме окиси мат ния эффективными для получения агрегентов флоккулированных клеток AftViMbacleH с увеличенной твердостью является ряд другах соединений .(по определению прибором Инстрон). В табл. 2 показаны результаты, полученные с различными добавками при осуществлении способа Методики. Некоторые соединения, например углекислый магний, .хлористый магний и углекислый кальций, являются неэффективными в случае и.х использования ,при осуществлении описьшаемого способа. П р и м е р 2. Для оценки эффективности настоящего изобретения способ осуществляют с применением другого микроорганизма, образующего глюкоизомеразу. В этом случае среду (250 мл), содержащую 1% пептона, О,25 % дрожжевого экстракта, 0,5% мясного экстракта, 0,05% семиводного сульфата марганла, О,5% хлористого натрия, 2% ксилозы к 0,ООЗ М хлористого кобальта засеивают Streptomyces oHRus АТСС 21132. Культивирование ва цут в однолитровой колбе на вращаюшемся столе при в течение 48 часов и затем ее используют для посева в 10питровый ферментатор, аэрируемый со скоростью 2,5 литра воздуха в минуту и перемешиваемый со скорость 200 об/ми Флоккулирование получившейся мецилально суспензии, равно как и оценку флоккулированнык агрегатов, производят как описано в примере 1. Пример 3. МикроорганнзмЪасяЕЕи COa uEiatts засевают на среду, содержащую 1% протеазы пантона, 1% дрожжевого экстракта, 0,8% 2% лактозы {стерилизованной).рН среды 6,O,HHKy6aumo проводят при в течение 48 часов на вращающемся столе. По окончании инку бации добавляют толуол (0,5% от объема) и смесь перемешивают ЗО минут. Флоккупяцию я извлечение аграгатов фпоккулированных клеток осуществляют по методике описанной выше для AH-tlthoboici:eh7 за исключением того, что добавляют 4,6 г/л Примафлок С-7 в виде1,5%-ного раствора и затем 1,5 г/л Примафлок А-1О в виде 1%-ного водного раствора. Оценку флоккулироваиных агрегатов (частицы 16-2О меш) производят обычным образом, за исключением того, что частицы погружают в 2%-ный раствор лактозы, имеющей , а не. 2М раствор глюкозы. Твердость по Инстрону равна 4,6 кг. Испытание активности лактозы этих, частиц дало 38,5 единиц на грамм сухого веса. Метод флоккуляцни дляБО С 22115Соа иРо1К5 повторяют за исключением того, что окись магния 2,5 г/л добавляют перед флокку- ляцией.. Полученные частицы 12-20 меш имеют твердость по Инстрону 6,0 кг и активность лактоэы 26,5 аяиниц. На выбор данной добавки для применения в настоягаем изобретеяяя влияют несколько факторов, включая стабильность внзима, оптимальный для эиаиматического превращения диапазон рН и реакцию микробных клеток на окулянты в присутствие выбранной добавки . Например щелочная добавка, такая как окись кальция, не будет пригодна для применения с энзимом, имеющим максимальную активность при рН-4, Конечный выбор добавки зависит от условий фактической работы так, что необходимы некоторыег опыты для; определения оптимального состава. Определения этого оптимального состава наиболее удобно делать Ьутем выбора вначале флоккулирующего агента или агентов, а затем оптимального количества и.х. Эффективность различных добавок при различных уровнях оценивают обычными методами. Количество добавки, требуемое для получения .-желаемой твердости, может изменяться от 1 до 12% по весу влажных флоккулируемых клеток. Предпочтительным является уровень от 2 до 6% по весу влажных клеток.

Сравнение скоростей течения раствора глюкозы клеток Afihrobactev

Клетки, флоккулирован- ные Примафлоком С-7 и А-1О, 75 г частиц, 16-2 О меш.

Клетка, флоккулированныв Примафпоком С-7 и Л-10, 75 г частиц, 16-20 меш. содержат окись магния

349,9

6,0

44

13,8

681,76

44 Таблица 1 через слой флоккулированных

Фпоккулшшя клеток Arlhl-obacler . В-3728 в присутствии различныхдобавок с применением флоккулирующих агентов Примафлок С-7 и A-lu

Твердость частиц меш,

Добавка, 2,5г по Инстрону, кг

3,3

2i,5

10,5

7,4 шя

6,О

6,7

2,9

2,2

2,8

Флоккулягаш Sti eptomycee оВЬиа АТСС 21132 в врясутствви раэпвчвых фnoJUcyлиpyкювx агентов и добавок

Примафлок О-7 (13,бг/л в виде 2,7%-ного водного раствора), затем П 1ма||лок А-10 (4,35г в 2,9%--ного водного раствора)

Примафлок С-7 (13,5 г/я в виде 2,7%-ного водяного раствора), затем Л мафлок А-10.(4,35 г/д в виде 2, водного раствора

Таблица 2

Активность глюкоиаомеразы,

.J;/r.

м

62,7 54,5 43,1 45,4 37,2 35,0 54,6 53,5 4О,4 46,5 59,4 41,3 49,6

Т а б л и д а 3

22,0

12,4

40,0

5,85

Контроль (без добавки)

Окись магния

л/л

Контроль (без добавки)

/л

Гидроокись кальция

1)Катфлок-г полиаплилдиметил, аммоний хлорид - катионкый электролит.

2)Делфлок 763-катионный полиэлектролит полиамидио эпяхлоргидрированного типа.

Формула изобретен ия

Экструзию флоккулированных клеток с пооледуюшей сушкой, отличают и и- с я тем, что, с целью увеличения твердости и стабильности агрегатов клеток, пеПродолжение табл. 3

12,0

6,5

1,8

34,0

10,0

3,2

6,5

5,9

ред введением флоккулянта в культураль- ную жидкость добавляют окись или гидроокись или фосфат илн сульфат магния или кальция или железа или марганца.

Источники информации, принятые во

внимание при экспертизе:

1. Патент -СССР № 544380, :кл. С 07 Q 7/02, 1973.