Способ получения агрегата бактериальных клеток SтRертомусеS oLIVaceUS Советский патент 1982 года по МПК C12N9/92 C12N11/02 C12P19/24 

39

термальных клеток Streptom)ces olivaceus, заключающемуся в том, что массу указанных бактериальных клеток выдерживают в контакте с поперечносшивающим агентом в щелочной среде в течение 0, ч,причем в качестве поперечносшивающего агента используют продукт взаимодействия 12-65 1 вес.% соединения, выбранного из группы,включающей глутаровый альдегид, трихлорангидрид циануровой кислоты и их сочетание, и; 88-3,9 весД водорастворимого катионоактивного полимера - продукта полимеризации эпихлоргидрина с алкиленполиамином формулы (2NRH,2,

где R - низший Сп-Сл - алкилен, а R и RQ- низшие , - алкилы,

указанный поперечносшивающий агент используют в количестве 6,5 55 вес.% от сухого веса клеток, и процесс ведут при рН 8-9 и температуре с последующим выделением целевого продукта.

После выделения агрегат сушат.

В качестве поперечносшивающего агента используют продукт взаимодействия вес.% глутарового альдегида и +2,9 вес. водорастворимого катионоактивного полимера в количестве 17,5 вес. в пересчете на сухой вес клеток.

В качестве поперечносшивающего агента используют также продукт взаимодействия ,9 вес. глутарового альдегида и 3,6 вес. трихлорангидрида циануровой кислоты, взятых в качестве глутарового альдегида, и 1,5 вес.% водорастворимого катионоактивного полимера в количестве 18,2 вес.% в пересчете на сухой вес

клеток.

I

Бактериальные клетки, содержащие активную глюкозизомеразу, которые могут быть использованы при осуществлении предлагаемого способа, можно получать в соответствии с известной технологией. Ферментсодержащие. клетки получают выращиванием в погруженном состоянии в аэробных уелоВИЯХ культуры Streptomyces olivaceus (обычно - штамм 3583) или их мутантов в среде, содержащей соответствующие питательные вещества известным способом. Полученные бактериальные клетки отделяют от ферментативной среды путем фильтрования и центрифугирования-. Компоненты ,которые используют при осуществлении такого способа, являются легко доступными. Особый эпигалоидгидринполиаминовый полимер, который используют при осуществлении предлагаемого способа, представляет собой технически доступный продукт, выпускаемый с товарным знаком БЕТЦ 1180 фирмой Бетц лабораториз, инк.Тревоз, шт.Пенсильвания. Молекулярный вес продукта БЕТЦ 1180 менее 1 000 000, его молекулы содержат приблизительно 0,288 ммоль, аминогрупп на грамм раствора (согласно данным нингидринового испытания), а сам продукт поступает в продажу в виде раствора содержащее 30 вес. сухого вещества в пересчете на общий вес раствора. Этот продукт является известным и охарактеризован как водорастворимый катионоактивный полимер, полученный полимеризацией хлоргидрина с алкиленполиамином, отвечающим общей формуле Rj RqNRNHn ,где R - низший алкилен, содержащий от 2 до 6 углеродных атомов, а каждым из символов R и R обозначен низший алкил, содержащий от 1 до 6 углеродных атомов, причем молекулярное соотношение между хлоргидрином и полиамином находится в интервале от 0,60:1 до 2,7:1) в процессе указанной полимеризации предусматриваются осуществление реакции алкиленполи амина с 50-90 эпихлоргидрина от тог количества, которое должно быть полимеризовано, продолжение этой реакции до момента достижения практически однородной вязкости реакционной среды и проведение реакции оставшейся части эпихлоргидрина в постепенно увеличивающихся количествах, в резултате чего образуется катионоактивный полимер, температура полимеризации находится в пределах от 60 до 120-С. В дальнейшей части данного .описания этот материал носит название полиаминового полимера.

В качестве поперечносшивающего реакционного продукта, необходимого для практического осуществления предлагаемого изобретения, в процессе получения агрегата бактериальных клеток можно использовать одну из трех .возможных композиций.Можно провести реакцию полиаминового полимера с глутаровым альдегидом или ангидридом циануровой кислоты, или же как с глутаровым альдегидом, так и с трихлорангидридом циануровой кислоты одновременно. Глутаровый альдегид трихлорангидрид циануровой кислоты, и их сочетание, объединенные под обобщающи названием глутарового альдегида, используют для реакции с полиаминовым полимером. При величине рН в интервале от 6 до 10 и температуре от О до ЗО-С в течение от 0,5 до 2,5 ч. В целом поперечносшивающий реакционный продукт содержит от 12 до б5,1 вес.. глутарового альдегида и примерно от 3,9 до 88 вес. полиаминового полимера в пересчете на общий вес активнодействующих ком понентов. Предпочтительно сшивающий агент, получаемый в результате реакции между глутаровым альдегидом и полиаминовым полимером, получают при величинах рН от 8 до 9, температуре 18 и в течение примерно 0,3 ч. Глутаровый альдегид должен присутствовать в молярном соотношении по меньшей мере 1:1 аминогрупп в молекулах полиаминового полимера, что препятствует нежелательному попереч ному сшиванию полиаминового полимера глутаровым альдегидом. Реакцию между только одним трихлорангидридом циануровой кислоты и полиаминовым полимером по предпоч тительному варианту проводят при величинах рН среды от 8 до 9 и температуре от О до в течение от 1 до 2 ч. Трихлорангидрид цианурово кислоты должен присутствовать в моля ном соотношении, равном по меньшей мере 1:1 аминогрупп в молекулах полиаминового полимера, что позволя ет предотвратить нежелательное попе речное, сшивание молекул полиаминово го полимера галоидангидридом циануровой кислоты. В молекуле трихлорангидрида циануровой кислоты, имеют ся три галогеновых реакционноспособ ных участка. Один из этих участков вступает в реакцию при температуре 0°С или выше. После завершения реак ции на этом первом участке при температуре от 30 до 50°С вступает в реакцию второй участок, а третий участок вступает в реакцию при температуре от 90 до . Желательно первоначально использовать для реакций с полиаминовым полимером только первые участки молекул трихлорангидрида циануровой кислоты. Образовав6шийся поперечносшивающий реакционный продукт используют в реакции с бактериальными клетками, после чего нагревают в процессе сушки до повышенной температуры, оставшиеся активные участки галоидангидрида циануровой кислоты вступают в реакцию с молекулами полиаминового полимера с обеспечением дополнительного поперечного сшивания бактериального клетч чного агрегата. Реакцию между полиаминовым полимером и сочетанием глутарового альдегида с трихлорангидридом циануровой кислоты проводят в несколько стадий. Сначала проводят реакцию трихлорангидрида циануровой кислоты с полиаминовым полимером при величине рН от 8 до 9 и температуре от О до IDС в течение от 1 до 2 ч. По предпочтительному варианту исходные реагенты для осуществления такой стадии следует использовать в молекулярном соотношении 1 моль трихлорангидрида циануровой кислоты на 2 моль аминогрупп в молекулах полиаминового полимера. Затем добавляют избыточное количество глутарового альдегида и реакцию проводят в тех же самых условиях рН и температуры в течение 0,5 ч. Используемый поперечносшивающий реакционный продукт не является катионоактивным полиэлектролитом, поскольку аминогруппы в молекулах полиаминового полимера, которые первоначально сообщали этому последнему катионоактивные характеристики, к этому времени уже прореагировали с глутаровым альдегидом и/или трихлорангидридом циануровой кислоты,, вследствие чего свободные группы уже отсутствуют. Бактериальные клеточные агрегаты получают путем введения массы бактериальных клеток в контакт с поперечносшивающим реакционным агентом, полученным в соответствии с предлагаемым, при величине рН от 8 до 9 и температуре от 5 ДО ЗО-С в течение от 0,5 до 1,5 ч. Поперечносшивающий реакционный агент используют в таких количествах и концентрации, что бактериальные клетки вступают в контакт приблизительно с 6,555 вес. активнодействующих компонентов поперечносшивающего реакционного продукта в пересчете на сухой вес клеток.

После завершения указанной реакции полученный бактериальный клеточный агрегат по предпочтительному варианту обычно экструдируют или подвергают формованию с сообщением продукту желаемой формы и сушат при температуре приблизительно в течение нескольких часов. Полученный сухой агрегат можно хранить до тех пор, пока он не понадобится для проведения ферментативного процесса. При этом высушенный агрегат Повторно гидратируют и готовят к использованию.

Полученные образцы подвергают испытанию на твердость с целью оценки их пригодности для использования в реакторах. Эта твердость выражается в стойкости к сжатию частиц бактериального клеточного агрегата. Испытания проводят с использованием разрывной машины Инстрон в сочетании с блоком сжимающей нагрузки NO.CCI в соответствии с ранее описанной методикой. Этот прибор выпускается фирмой Инстрон корпорейшн Кантон, штат Массачусетс.

Ниже приводится процедура испытаний по определению твердости после повторной гидратации.

Раствор для повторной гидратации готовят путем смешения 9,68 г гексагидрата хлйристого кобальта, 28,0 г гидрата окиси магния и 5б,0 г безводной лимонной кислоты в 600 мл дистиллированной воды при °С. Эту смесь далее перемешивают и нагревают до 60°С с растворением всех солей. Затем смесь охлаждают до 25°С и доводят величину рН до 8,5 добавлением гидрата окиси натрия. Далее раствор фильтруют и доводят его объем до 1,0 л добавлением дистиллированной воды. Порцию в 2,5 м указанного раст вора смешивают с 130 мл воды, 70,3 г декстрозы, 2,228 г трис-(оксиметил)-аминометана и доводят величину рН до 8,55 добавлением гидрата окиси натрия при 25С. Затем объем доводят до 200 мл добавлением дистил лированной воды.

Проводят конверсию 5 частиц высушенного бактериального клеточного агрегата с использованием 2,5 мл указанного раствора для повторной гидратации в чашке Петри и выдерживают при 60°С в водяной бане в течение 1 ч, а затем оставляют стоять при комнатной температуре до охлаж290U8

дения. После этого частицы удаляют из раствора, удаляют также из него избыток поверхностной жидкости и проводят испытания с применением

5 разрывной машины Инстрон. Перед применением данного прибора для проведения измерений его подогревают в течение по меньшей мере 30 мин совместно со смонтированным на нем

10 блоком сжимающей нагрузки. Устанавливают скорость движения ползунка на уровне 5.1 мм/мин и скорость движения диаграммы 51 мм/мин. Переводят ручку Возврат до половины

15 хода, доводя ее до уровня 0,9б5 мм для поверхности блока нагрузки. Устанавливают ручку Длина испытываемой части образца таким образом, чтобы очистить кромку чашки для образца. Задают на самопишущем приборе диапазон всей шкалы. Это обычно составляет ,5 кг. Стандартизируют самопишущий прибор таким образом, чтобы считывать нулевое число с чашкой для образца на блоке нагрузки и 1 фунтом (0,5 кг), с чашкой и 1 фунтом (0,45 кг) стандартного веса на блоке нагрузки. Помещают единственную частицу после повторной

30 гидратации на чашку для образца,которая сцентрирована с ползунком. Вручную опускают ползунок на верхнюю часть частицы и нажимают кнопку Ход На самопишущем приборе считывают уси, лие в фунтах (килограммах) на расстоянии 0,03 дюйма 0,7б2 мм от точки,в которой ползунок касается частицы. .Таким образом твердость выражается в усилии (в фунтах или килограммах.) ,

4Q необходимом для сжатия частицы на 0,03 дюйма (0,762 мм). Этот эксперимент повторяют на нескольких частицах, а полученные результаты усредняют.

Д5 Пример 1. Поперечносшивающий реакционный продукт получают добавлением 2,25 г раствора БЕТЦ 1180, содержащего 0,675 г активнодействующего материала и 0, ммоль аминогрупп, в 100 мл 1,25%-ного

(вес на объем) раствора глутарового альдегида, содержащего 13,2А ммоль активнодействующего материала, при величине рН, равной 9. Эту смесь перемешивают в течение 30 мин, в результате чего получают раствор глубокой желтой окраски. Конечный продукт получают из реакционной смеси, которая содержит 64,9 вес.% глутарового альдегида и 35 1 весД полиаминового полимера в пересчете на общий вес глутарового альдегида и полиаминовый полимер.

Культуру мутанта Streptomyces olivaceus NRRh 3583 выращивают в ферментере с перемешиванием и аэрацией, в котором содержалась соответствующая питательная среда. Величину рН питательной среды ферментора, содержащую массу бактериальных клеток, доводят до 8,2 добавлением соответствующих, буферных материалов. Часть приготовленного раствора добавляют в порцию питательной среды ферментора в таком количестве, которое необходимо для достижения эквивалента k вес.% глутарового альдегида (21,6 вес.% от всего количества реакционного продукта) в пересчете на сухой вес бактериальных клеток. По истечении 30-минутного промежутка времени реакции при 25С и величине рН, равной 8,2, обработанню среду отфильтровывают. Затем фильтровальный пирог подвергают экструдированию через шприц с диаметром отверстия 2,2 мм. Отформованные таким образом экструдированные нити разрезают на отрезки длиной 30 мм и высушивают в течение ночи при 65°С в печи с принудительной циркуляцией горячего воздушного потока. Аналогичную порци питательной среды ферментора обрабатывают только одним глутаровым альдегидом при концентрации 14 вес.%

290Н10

в пересчете на сухой вес бактериальной клеточной массы. Затем обработанные клетки отфильтровывают, экструдируют и высушивают таким же 5 образом с получением контрольных частиц. Как контрольный продукт,так и продукт, получаемый по предлагаемому изобретению подвергают испытаниям на определение твердости. Твердость контрольного образца 0,36 кг,

10 тогда как продукт, обработанный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает повышенной твердостью, равной 1,27 кг.

Пример 2. Порции питатель15ной среды ферментера с микроорганизмом Streptamyces olivaceus, аналогичной упомянутой в примере 1, подвергают обработке только одним 20 глутаровым альдегидом (контрольный эксперимент) и различными сочетаниями поперечносшйвающих агентов при величине рН, равной 9. и температуре . Различные поперечносшивающие агенты получают в соответствии с из25ложенным в приведенном примере 1 с использованием различных количеств глутарового альдегида и полиаминового полимера. Затем обработанные бактериальные клетки отфильтровы30вают, экструдируют, высушивают и подвергают испытанию на определение твердости.

В табл.1 показана реакционная смесь для приготовления композиции,

35 из которой получают поперечносшивающий реакционный продукт.

Т а б л и ц а 1

Использование поперечносшивающего агента на основе глутарового альдегида и полиаминового полимера позволяет существенно повысить твердость в сравнении с той твердостью, которая достигается с использовани11ем в соответствии с известным способом только одного глутарового альдегида. Пример 3- Поперечносшивающий реакционный агент получают растворением 0,188 г трихлорангидрида циануровой кислоты (0, ммоль) в 10 мл ацетона, а затем этот раствор при перемешивании добавляют к 70 мл водой, охлаждаемой льдом, с получением тонкодисперсного осадка.Порцию в количестве 2,25 г раствора БЕТЦ 1180 (содержащего 0,675 г активнодействующего материала и 0,6А8 ммоль аминогрупп) разбавляют добавлением 20 мл воды и добавляют смесь в суспенз.1Ю трихлорангидрида циануровой кислоты. Конечную смесь подвергают перемешиванию и выдерживают при величине рН 9 и температуре 0-5°С в течение 1-2 ч, после чего разбавляют до объема 100 мл. Трихлорангидрид циануровой кислоты рас воряется, указывая на реакцию с полиамином. Этот реакционный продукт получают из реакционной смеси, кото рая содержит 21,8 вес. трихлорангидрида циануровой кислоты в качест полиаминового колимера. Часть питательной среды, аналогичной указанно в примере 1, из ферментера с микро.организмом Streptomyces olivaceus смешивают с частью указанного реакционного продукта с достижением кон центрации 32,0 вес. реакционного продукта в пересчете на сухой вес бактериальных клеток.О,2 (вес на объем) водного раствора бикарбоната натрия добавляют для поддержания величины рН на уровне 9- По истечен 1 ,5 ч при величине рН 9 и температу ре 25 С обработанную питательную ср ду фильтруют, экструдируют и высуши вают. Другую часть питательной сред ферментера обрабатывают согласно из ложенному в течение 0,5 ч. В началь ной стадии не добавляют бикарбоната натрия, но отфильтрованные клетки промывают раствором бикарбоната нат рия концентрацией 1 вес. при велич не рН 9 перед экструдированием и вы сушивают. Для получения контрольног продукта в отдельную порцию питател ной среды из ферментера добавляют глутаровый альдегид при концентрации 1А вес. в пересчете на сухой вес бактериальной клеточной массы. Полученную массу обрабатывают глутаровым альдегидом в течение 30 мин 12 при величине рН 8,2 и температуре с последующим фильтрованием, экструдированием и сушкой. Твердость контрольного продукта 1 кг, тогда как в результате обработки указанным поперечносшивающим продуктом в течение 0,5 ч получают продукт с твердостью 1,73 кг, а в результате обработки им же в течение 1,5 ч достигают твердости 1,82 кг. Пример 4. Поперечносшивающий реакционный продукт получают добавлением ,5 г раствора БЕТЦ 1180 (содержащего 1,35 г активнодействуюЩего материала и 1,29б ммоль аминогрупп) в 0,118 г (0, ммоль) тонкоизмельченного трихлорангидрида циануровой кислоты в воду, охлаждаемую льдом. Величину рН доводят до 9 и поддерживают на этом уровне в ледяной бане (при 0°С) в течение 2 ч. Затем добавляют 1,25 г (13, ммоль) глутарового альдегида при величине рН 9 и низкую температуру поддерживают в течение приблизительно 0,5 ч.Смесь приобретает темно-желтую окраску. Реакционный продукт получают из реакционной смеси которая содержит ,3 вес. трихлорангидрида циануровой кислоты, А6,0 вес.% глутарового альдегида (всего 50,3 вес. глутарового альдегида) и 49,7 вес. полиаминового полимера в виде глутарового альдегида . Порцию питательной среды, аналогичной питательной среде примера 1, из ферментера с культурой микроорганизма Streptomyces olivaceus смешивают с порцией указанного поперечносшивающего продукта с достижением концентрации 30,4 вес.% реакционного продукта в пересчете на сухой вес бактериальной клеточной массы. После истечения 0,5-часового реакционного периода при величине рН 9 и температуре 25°С обработанную питательную среду фильтруют, промывают водным раствором бикарбоната натрия концентрацией 5 вес. при величине рН 9 экструдируют и высушивают. Контрольный образец получают таким образом, как это описано в примере 3. Твердость контрольного продукта 0,36 кг, тогда как твердость, достигнутая с использованием указанного поперечносшивающего продукта достигает 1,73. кг. Пример 5- Порции питательной среды из ферментера с культурой микроорганизма Streptomyces otivaceus, аналогичной упомянутой в примере 1, обрабатывают только одним глутаровым альдегидом (контрольный эксперимент) и различными сочетаниями поперечносшивающих продук.тов при величине рН 9 и температурах 25 и 5 С. Во всех случаях поперечносшивающие реакционные продукты,которые используются, включают в себя 1 моль трихлорангидрида циануровой кислоты на 2 моль аминогрупп в поли25°С100 КонтрольКак видно из приведенных данных, бактериальные клетки, обработанные поперечносшивающими реакционными продуктами согласно предлагаемому изобретению, обладают заметно повышенной твердостью в сравнении с бактериальными клетками, которые были обработаны в соответствии с известным способом только одним глутаровым альдегидом.

В случае использования поперечносшивающего реакционного продукта,полученного из глутарового альдегида и полиаминового полимера, предпочтительную композицию готовят из смеси вес.% глутарового альдегида и 2,9 вес.% полиаминового полимера 9290 5 10

в пересчете на общий вес активнодействующих ингредиентов. По предпочтительному варианту эту композицию следует также применять в количестве 17,5 вес.% в пересчете на сухой вес бактериальных клеток. В том случае, когда используют поперечносшивающий реакционный продукт, полученный из глутарового альдегида, трихлорангидрида циануровой кислоты и полиаминового полимера, в соответствии с предварительным, вариантом, композицию следует получать из смеси 5,9 вес.% глутарового альдегида и 3,6 вес. трихлорангидрида циануровой кислоты и 41,5 вес.% полиамино вого полимера в пересчете на общий U аминовом полимере. Затем готовят сочетания, которые указаны а табл.2. Затем обработанные бактериальные клетки фильтруют, экструдируют, высушивают и подвергают испытаниям на определение их твердости. В табл.2 показана композиция реакционной смеси для получения поперечносшиващего реакционного проду.ста. Таблица 2 15 вес активнодействующих ингредиентов. По предпочтительному варианту эту композицию следует Также применять в количестве 18,2 весД в пересчете на сухой вес бактериальных клеток. Все бактериальные агрегаты, полученные в соответствии с изложенным, проявляют способность к конверсии глюкозы во фруктозу. Практическое осуществление предлагаемого способа не ухудшает глюкозизомеразной активности . Основное преимущество и техникоэкономическая эффективность данного изобретения состоит в достижении твердости бактериального клеточного агрегата после повторной гидратации в сравнении с бактериальными клеточными агрегатами, получаемыми по ранее известным способам. ФормуТ1а изобретения 1. Способ полумения агрегата бактериальных клеток Streptomyces oliva ceus, предусматривающий выдерживани массы бактериальных клеток в контак те с поперечносшивающим агентом в щелочной среде в течение 0,,5 ч, отличающийся тем, что, с целью повышения твердости получае мого продукта, в качестве поперечно сшивающего агента используют продук взаимодействия 12-65,1 вес.% соединения, выбранного из группы,включающей глутаровый альдегид, трихлор ангидрид циануровой кислоты и их сочетание, и 88-3,9 вес.% водорастворимого катионоактивного полимера продукта полимеризации эпихлоргидрина с алкиленполиамином формулы , где К - низший алкилен, а Rq - низшие - алкилы, причем указанный поперечносшивающий агент используют в количестве 6,5-55 вес.% от сухого веса клеток, и процесс ведут при рН 8-9 и температуре 5-30°С с последующим выделением целевого продукта. 2.Способ по П.1, о тли ч а ющ и и с я тем, что после выделения агрегат сушат. 3.Способ по п.1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что в качестве поперечносшивающего агента используют продукт взаимодействия 57,1 весД глутарового альдегида и А2,9 вес. водорастворимого катионоактиеного полимера в количестве 17,5 вес. в пересчете на сухой вес клеток. . Способ по П.1, отличающийся тем, что в качестве поперечносшивающего агента используют продукт взаимодействия ,9 вес. глутарового альдегида и 3,6 вес. трихлорангидрида циануровой кислоты, взятых в качестве глутарового альдегида и 41,5 вес.% водорастворимого катионоактивного полимера в количестве 18,2 вес. в пересчете на сухой вес клеток.