Способ проведения ферментативной реакции Советский патент 1977 года по МПК C07G7/02 

(54) СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ

Клетки отделяются путем декантации большей части прозрачной жидкости с последующей фильтрацией на вакуум-фильтре.

Для облегчения фильтрации жидкости через слой агрегированных клеток перед агрегадией в суспензию микробных клеток вводят дополнительное средство, например, целит 545 в количестве 0,5% (вес/объем).

Полученные агрегированные клетки перед контактированием с субстратом сушат при 55° С или замораживают при минус 5° С с последуюш,ей выдержкой их в замороженном состоянии в течение 8 час и оттаиванием.

Затем агрегированные клеткн взмучивают в воде и измельчают, например с помощью смесителя Уоринга.

Затем взвесь заливают в колонку, частично заполненную водой, где клетки осаждаются.

Через колонку пропускают субстрат, например 50%-ный раствор глюкозы, при этом ферментативную реакцию осуществляют при рН 6-10 при температуре 50-90° С.

Скорость вывода раствора регулируют так, чтобы конверсия глюкозы во фруктозу составляла 40-50%.

Возможна последовательная установка двух колонок и извлечение насадочного материала из колонок для последующего применения в изомеризации глюкозы, при этом активность пзомеразы сохраняется.

Возможно также использование в качестве микробных клеток вида Streptomyces, при этом наиболее пригодными являются Streptomyces albus, Streptomyces echinatur, Streptomyces achromogenes, Streptomyces olivaceus и другие.

Способ апробирован в лабораторных условиях.

Пример 1. Микробные клетки Arthrobacter JNtRRZ В-3788 вносят в стерилизованную питательную среду состава, %: 2 декстрозы; 0,3 мясного белка; 0,1 дрожжевого экстракта, 0,6 (NH4)2HP04; и 0,01 MgSO4-7H2O с рН -6,9.

Ферментацию проводят при 28° С в течение 60 час, после чего рН среды равно 5,5. Затем добавляют 2% (вес/объем) раствора Примафлок С-7 до получения конечной концентрации 0,25% (вес/объем). Предварительно рН полиэлектролитного раствора устанавливают 5,0 и ферментационную жидкость во время его добавления легко перемешивают. Перед введением полиэлектролитного раствора добавляют 0,5% (вес/объем) целита 545 (фирмы Джекс-Менвил, Балтимор).

Перемешивают до образования стойких агрегатов клеток примерно, в течение 10 мин, после чего клеточным агрегатам дают возможность агломерироваться, а затем клеточный материал отделяют от прозрачной жидкости с помощью вакуум-фильтра.

Агрегированные клетки перед применением замораживают при минус 5° С или сушат при 55° С.

При испытании отделенной культуральной

жидкости обнаруживается полное извлечение изомеразы путем флоккуляции.

Пример 2. Проводят непрерывную конверсию глюкозы во фруктозу с применением флоккулированных клеток, полученных по примеру 1 и хранившихся несколько часов при минус 5°С.

Замороженные флоккулированные клетки ногружают в воду или в глюкозный сироп, дают массе клеток оттаять и измельчают их перемешиванием или другими механическими средствами до получения частиц одинаковой крупности. Затем эту взвесь вакуумируют 30 мни для удаления газов и вносят в колонку диаметром 23,5 мм, имеющую рубашку, частично наполненную водой или глюкозным сироном.

Колонку нагревают до 60° С и пропускают 2 М раствор глюкозы, содержащий 0,004 моля MgCl2-6H20 со скоростью, необходимой для получения заданной степени конверсии глюкозы, например, до 50%.

Пример 3. Получают сухие флоккулированные клетки и ирименяют их в колонке при неирерывном нроцессе изомеризации глюкозы во фруктозу, исиользуя катионный и анионный флоккулирующие агеиты.

Пять частей свежей культуры Arthrobacter нри рП 5,6 обрабатывают одной частью 1%-ного (вес/объем) раствора катионного Примафлок С-7.

Ферментационную жидкость, содержащую флоккулянт, медленно перемешивают до образования больших клеточных агрегатов, после чего добавляют одну часть 1%-ного (вес/объем) анионного Примафлок А-10 (фирмы Ром и Хаас) и иродолжают перемешивание до раздробления больших агрегатов в тонкие частицы. Затем флоккулированным клеткам дают возможность агломерироваться (см. нример 1), нрозрачную жидкость отделяют, а клетки отделяют путем вакуум-фильтрации.

Перед добавлением к ферментационной среде рП флоккулирующих растворов устанавливают едким натром, рН раствора катионного Примафлок С-7 устанавливают 5,0 и анионного Примафлок А-10-7,0, а конечный рП составляет 5,6.

Отфильтрованные клетки экструдируются через мундштук перед их сушкой в сушилке с принудительной циркуляцией в течение 24 час при 55° С.

Высушенные клетки гранулируют в барабаие, просеивают до 20-40 мин и гранулят помешают в колонку.

Пзомеризацию глюкозы проводят по примеру 2.

Пример 4. Aspergillus niger культивируют в питательной среде, состоящей из глюкозы, фруктозы, MgSO4-7H20, КН2РО4,

NH4HPO4, мочевины и кукурузного настоя.

По окончании периода ферментации к среде добавляют 0,3% (вес/объем) полиэлектролита, перемешивают до агрегации клеток,

флоккулированные клетки отделяют и загружают в колонку с рубашкой.

Колонку нагревают до 40° С и пропускают 5%-ный раствор инвертного сахара, получая жидкую смесь, содержащую глюконовую кислоту и фруктозу.

Пример 5. Streptomyces olivaceus штамм № NRRZ В-3583 культивируют в питательной среде, содержаш,ей, %: 0,7 ксилозы, 0,3 декстрозы, 0,5 мясного экстракта. О, 25 дрожжевого экстракта, 1,0 пептона, 0,5 NaCl, 0,05 MgSO4-7Н2ОиО,024СаС12-6Н20.

Ферментацию проводят при 28° С 24 час. К ферментационной жидкости добавляют 2%-ный (вес/объем) раствор катионного полиэлектролита в количестве, эквивалентном 0,05% (вес/объем) сухого флоккулянта, жидкость перемешивают до образования агрегированных клеток, после чего перемешивание прекраш,ают и дают возможность последним осесть.

Агрегированные клетки отделяют по примеру 1, после чего их сушат 24 час при 60° С, механически измельчают и загружают в колонку, частично наполненную 1,0 М раствором глюкозы.

Колонку нагревают до 70° С и пропускают I М раствор глюкозы, содержащий О, 04 М. раствор MgCb-BHoO для конверсии глюкозы во фруктозу.

Пример 6. Saccharomyces cerevisiae культивируют в питательной среде, содержащей мелассу. После ферментации добавляют раствор полиэлектролита при перемешивании, достаточном для образования агрегатов клеток.

Флоккулированную клеточную массу отделяют и помещают в колонку, которую поддерживают при 60° С.

Через колонку пропускают 0,5 М раствор сахарозы, которая превращается в инвертный сахар.

Пример 7. Aspergillus oryzae культивируют в среде, содержащей пшеничные отруби в смеси с углеводами, минеральными и буферными веществами.

Ферментацию проводят 48 час при 30° С и затем добавляют раствор подходящего полиэлектролпта при перемешивании, достаточном для агрегирования клеток.

Флоккулирование клетки загружают в колонку, поддерживаемую при 50°С. Через колонку пропускают нейтральный 0,2 М. раствор ацетил-ДЛ-метионина, содержащий 5Х Х10- МСо+±, получают Л - метионин.

Формула изобретения

1.Способ проведения ферментативной реакции путем контактирования субстрата с суспензией микробных клеток, обладающей ферментативной активностью, отличающийся тем, что, с целью обеспечения возможности многократного их использования, микробные клетки перед контактированием агрегируют, обрабатывая флоккулирующими агентами-полиэлектролитами.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед агрегацией в суспенцию микробных клеток вводят дополнительно средство, облегчающее фильтрацию жидкости через слой агрегированных клеток, например целит 545.

3.Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве флоккулирующих агентов применяют анионные или катионные полиэлектролиты.

4.Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что при использовании в качестве субстрата глюкозы ферментативную реакцию осуществляют при рН 6-10 и температуре 50- 90° С.

5.Способ по пп. 1-4, отличающийся тем, что агрегированные клетки высущивают перед контактированием с субстратом.