Способ получения препарата простагландина ряда , обладающего противовоспалительным действием действием Советский патент 1978 года по МПК A61K31/5575 C07C405/00 

Препарат простагландинов ряда е можег быть получен методом, известным в получения соединений аналогичной СТруКТурЫ.

Получение пренарата может выключать п ос ледов а т€ л ь н ость с т а ди и:

а)получение прюизводного А

, (.М) - NH . COi (СНг).. - СООН из ма-кр о молекулы (М) NHa, например, реааодией с соответстауюш.лм а-нгид.ридом кислоты СО (СН2) :х.СО О;

б)получение яз ироизводного А произигаднОГО В

(М) - NH - СО (СПз). СО . Y - Н (Bj реэкцией .с соответствующим бпс-амином H-Y-Н;

с) 1сочетание с про.иЗВОДным В соответствующего простагландина (PG)-СООН или смеси иростагландинов с получением конечного преиарата.

При иолучении препаратов, в которых прОСтагландиновая и макромолекул-ярные част.и сВЯзаны ирямо, ка1к при стадии получения препарата, содержащих связанную груятиу, предпочтительно используют один из методов, известных в облаСти синтеза таких соединений, для обеспечения образования, пептидной СВЯЗИ, например исиользован ем ка.рбодиИМида, использованием реагента К Ву-дварда или методом смещанных ан ридридов.

При ир 1мен€нш1 карбодшгмида наиболее пр.едпочтительиым является такой, ка:К. наlOHiviep, iN - (3 - диметилампнопропил) - Nэтилкарбодиимид и X - (З-диэтилами.иоиролил)-этилкарбодивмид, п случае которого побочный продукт реакнии, соответственно M-o4et3Hna, водорастворим ,п быть отдпализован из реакиионпой смеси.

Подходящими реагента мн для метода смешаиных ангидридов являются этилхлорформиат, изобутилхлорфо рмиат и изабутилхло,рка1р|бонат. Проводят реакцию в присутствИИ третичного оргапическОГО основания, такого как триалкила.мин, иаиример триэтиламин или три-н-бутиламин или Х-метилморфолин. Реагент К Вудварда представляет собой Х-этпл-5-фенилизоксазрил:и.л -3 -Су льа) он а т.

При получении препаратов, в которых присугсивует связующая г-руниа, к{)нден1саиия простагландина (PG)- СООН возможна и с fBHOBb синтез.ироваийой а:миногрунпой {появившейся из-за включения бу.с-амина Н-Y-Н) и с любой нз оригинальных амин.о.групп -В исходном веществе (М)-МП2, коTopbie 0|Стались свободны-ми и реакционно aiKTHiBHb MH.

Предпочтительным является 12-кратны« 1мол1я,р,ный избыток ангидрида по отношению к общ-ему числу аминогруип, а s том случае, когда в макромолекуле (М)- NFI.) содерл ;атся остатки тирозина (как, например, в случае сывороточного альбумина быка), желательн о проводить эту стадию при слабо щелочном рН, например 8,0, для избежания аиилирования гидроксильных

групп тирозина.

Кондевсация быс-амина, Н-N-Н ироизойдет не только с вновь синтезированной карбоксильной группой (появляющейся в результате воздействия ангидридом кислоты), но и с любой свободной и реакционноактивной карбоксильной грлшпой, присутствующей в исходном соединении (М) - ХН2. Для того, чтобы избежать поперечного ещпвания продукта, бнс-амин Н-У-Н желательно вводить в реакпию в олень больщом избытке.

Препарат простагландииа ряда: е, обладающий противовоапалительиым действием, может быть использован для профилактики и тералии заболеваиий, иаиример язвенных колитов, нарущеппя соедин ггельпых тканей, неинфекпиолиых артритов, ревматических артритов, подагры и дегеиеративных aprpjiтов, болезней состояния с острыми или хроиически.ми восиалительными изменения.ми, первично обхтловлеННыми аллергИческими или геммунологическими причинами, иапри.мер а.1лергическпй репит, краиивпица, экзема и другие аллергические кожиые забо.леБания н воепалительныг состояния глаз, а та-кже ра.сстройства, обхтлоалепиые аггрегапией тромбоцитов крови.

Желательно, чтобы макромолек лярная чаеть иреиарата была неантигениой для видов, которым назначается введение этого препарата, 1иоэтом 1препараты, которые и.реднаЗИаЧены для введения человеку, иолучают из белковых фракций сьшоротки кр01ви чел.овека, таких как сывороточный 1ЛьбуУ ИН человека или сывороточный глобзл.ии человека.

Препарат вводят любым известным способом, например подкожные, внутрикожные Is л и вн тг1ПМЫШечные ииъекции. „ Пренарат может .включать водные суспензии активного ИНгредиента, водные растворы, где водной средой является, например, неннрогенная вода или физиологический раствор и такие суспензии и растворы

0 могут быть приготовлены при пеоб.ходимости добавлением водной среды к иорошжсобразиом - иигредиеиту. В препарат может 6biTjj включено вспомогательное средство для усиления иммунной реакции на активиый ингредиеит. Подходящими вспомогательными средствами являются соли алюмипия или кальция, например калиевыг :квас:пы и фосфат кальция, растительное маелс (Налри.мер арахисовое) пли мине

ральное масло, а та1Кже может р.1ть .вклю:чеп в препарат эмульгирующий агент, сус пензпи .убитых бактерий, например Согупст .bacterium parvuni, буферы, предохраняющие средства (включая антиоксиданты) и веще

о ства, включенные в состав дл.;1 того, чтобы

препарат был изотоническим по отношению к крови иредиолагаемого рециииента. При м е ) 1.

A.Получение препарата сывороточного альбумина быка с простагландином е

(PG8,).

Простагландин ei (20 мг) растворяют в 0,02 вес. % растворе карбоната натрия, в 10%-ном водном этаноле (20 мл. К этому раствору добавляют 46 мг бычьего сывороточного альбумина и 20 мг -(З-дпметпламинопропил) - N-этилкарбодиимидгидрохлорид и получившуюся смесь перемешивают 24 ч при комнатной температуре. Затем с.месь диализуют при 4° С 24 ч против буфера (0,005 М Na2HP04/Nan2P04, рН 7,0, ОЛ5 М NaCl при рП 7,2).

Твердый остаток 315 мг, полученный лио фллизацией, содержит 2,06 мг простагландина 6 (т. е. около 9,6 молей PCs на 1 моль сывороточного альбумина быка) поданным измерения молярного коэффиииеита экстинкции простагландиновой части препарата е,„ 27,200).

Б. Иммунизация крыс.

Крысы «Вистар (21 шт.) трехнедельного возраста «а две группы. Одной групле делают подкожные инъекции с месячными Интер1вала1ми (всего 3 инъекции) препарата сьюо.роточ.ного альбумина быка с PGei (500лг«:г), эмульгированного в иолIHOM вспо могательном средстве Фройнда (0,1 мл. Контрольной группе делают инъекции одного всиомогательно-го полного средства Фройн-да (0,1 мл) по такой же врем1енной с.хеме.

B.Измерения титров антител.

Через месяц после последней .инъскщггг ио два животных из группы (.низированной и контрольной) анестезируют «ем бут а лом и производят отбор «рози по 2 мл введением полой иглы в нисходящую часть дуги аорты и в трубку, содержаидую 0,1 мл геиарина 5000 ес/.ил. После осторожного встряхивания кровь центрифугируюг (5000 g) 20 мин, удаляют плазму и разбавляют буферам трис-НС грис-(оксиметил)а.мпнометан до рИ 7,5 для получен:ия разбавлений 1:2 и 1:5. По 0,5 мл алнквот неразбавлеиной или разбавленной плазмы в пробирках смешивают с PGe и затем иробир«и инкубируют пр-и 4° с 18 ;.

Котда инкубацию заканчивают, добавляют цолиэтиленгликоль - 4000 (0,5 лг.г; 25%-ный водный раствор) и содержимое пробирок перемешивают :И переносят в охлажденные ценТ;ифу кные пробирки. После 30-ми.нутНОГо центрифугирования отбирают 0,1 мл суиериатанпта и оценивают радиоактивность образца мето:дом лзмсргн.пя радиоактивности с, жидким сццптилляточом. Сра,чнен«е полученной величины ,с радиоактивностью,- введенной в начале, позволяет ,рс.:счигать связывание с плазмой, т. е. меченын простагландмн, осажденный с бетком.

Г. Измерения зоаиалительной реакцчи.

Измерения делают через месяц после последней инъекции препарата. Жпвотных иммунпзированны.х и контрольных не KopNiHT в течение ночи и на следуюший день вызывают воспаление введением под подошву одной лапы каррагишша (0,1 .i;.7 0,5°о ного раствора в физиологическом растворе). В TO же время з контралатеральную лапу вводят подобной же инъ&кцней 0,1 мл одного физиологического раствора. Объем лаиы измеряют методом вытеснения ртути и увеличение в результате вызванного воспаления рассч11тыпа от вычитанием объема контрольной лапы из объема лаиы, в котор Ю была сделана инъекция каррагицина.

П р и М е р 2.

Получение препарата бычьего сывороточного альбум на с простагландином s, соСВЯЗ ЮП1,ЧО

лержаи1его пп(1меж точн ю

группу.

A.Сукцинилированньп сывороточный альбумин быка (Сук-БСА).

Кристаллический сывороточный альбу:мин быка 5,0 г растворяют в 100 мл воды п охлаждают раство,р до ОС. 5,0 г ЯНтар«ого ан1ндрида постепенно добавляют прл перемешивании з течение 1 ч, иоддерживая рИ равным 8.0 добавлением 1,0 н. гидроокиси натрия. После добавления гидрида смесь выдерживают протекан 1я реакции 30 мин. Обихий расход 1 н. г 1дроок:1си натр11я соста1вляет 98,6 мл. Раствор диализуют при против часто сменявшейся днстилл,1 |10Банной во:ды. Содержимое тр чки лчофилизируют и получают 5,71 г аморфного порошке. Пингидрированная реакц:1М показала, что вес ам:1ног;з 1пы в а.льбхмпне были п;;1осукц11ниЛ|Ированы.

Б. Реакция Сук-БСА с З.З-диампнодипропиламииом.

70 мг сукцинилирова-нного бычьего сывороточного альбумина растворяют в 25 м.г воды. Добавляют к раствору 1,59 г дцгидрохлорцд 3,3-диаминодппроииламина и 0,80 г гидрохлорид Э1;1лд1гэтиламциоиропплкар0од П1Мида. рП раствора доводят до 5,0 д.); бавленнем 0,5 н. раствора соляпой кислоты и реакционную см1-:сь перемешивают ;; темноте в течение. 24 / при компатноГ Tt-Mпоратуре. Раствол диализуют при 4 С против часто сменявшейся дистпллированной воды. Содержимое трубки лиофилизуют и получают 80 .iiJ белого аморфного порошка (ЛАП-Сук-БСА).

B.Пол че;|ие препарата простаглантипа с ДАП-С -к-БСА.

30 мг нростагландпна е (PGt--) растворяют .-в. эта:,оле,-содержап.гем 30 Л).г 0,02%ного водного раствора карбоната натрия. Добавляют 60 мг ДАП-Сук-БСА и 30 мг гидп ох допил этплтиэтплямпнапппттил1 -ЯП