Конъюгат аденилил(2 @ -5 @ ) аденилил-(2 @ -5 @ ) аденозина с бычьим сывороточным альбумином, используемый для получения антител, специфичных к 2 @ , 5 @ - олигоаденилатам Советский патент 1992 года по МПК C07H21/00 C07K13/00 A61K39/02 

Описание патента на изобретение SU1735307A1

Изобретение относится к биохимии, конкретно к конъюгату формулы I:

шW

но

л

Y7l

Ade

н-SX

W

БСА.-5ыч1ш сыбороточный альбумин ,

который может быть использован для получения антител, специфичных к 2 ,5-олиго- аденилатам.

2|,5|-Олигоаденилаты - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которые являются медиаторами противовирусного действия интерферона (1). Эти соединения присутствуют в различных органах и тканях и обладают широким спектром биологической активности (2). Концентрация 2,5 -оли- гоаденилатов в клетках зависит от гормонального статуса организма и уровня циклических нуклеотидов. Это свидетельствует о возможности использования 2, олигоаденилатов в качестве лекарственных препаратов, а также для создания на их основе средств микроанализа для диагностики различных заболеваний (вирусные, аллергические, аутоиммунные и т.д.).

Широкое распространение для определения природных соединений в биологических объектах получили методы, основанные на использовании антител, специфичных к этим соединениям. 2,5 -Олиго- аденилаты сами по себе не обладают иммуногенностью, поэтому для получения иммунного ответа у животных они могут быть использованы для иммунизации в виде конъюгатов с белками. Так как в общем пуле 2,5 -олигоаденилатов в клетке основная доля приходится на тример, то естественно, что конъюгаты должны быть получены на его основе.

Известен конъюгат аденилил(2-5)аде- нилил(2-5)аденозина с БСА формулы:

пАйе

T7I

НО 0-Р-О 0-1/0

Ade

W

НО 0-Р-О

i-vQ|ue

®-W чшв котором связь тримера с белком осуществляется путем периодатного окисления, 2,з -цис-диольного фрагмента 2 -терми- нального аденозина с последующими конденсацией образующегося диальдегида с аминогруппами белка и восстановлением Шиффовых оснований (3). Такой способ получения в данном случае приводит практически к разрушению одного звена в молекуле

антигена, что не может не сказаться на специфичности вырабатываемых животным антител.

Более близким по сути к предлагаемому является конъюгат формулы:

Ho-yONMe

W §

НО Q-P-Qi-jAf

@Н1н-с-снг-снгс-о о-8-снгснгс-кн-©

Полученный путем конденсации 0-сукципильного производного аденилил-(2 -5)аде- нозина с БСА (4). Существенным недостатком такого конъюгата является наличие в молекуле лабильной сложноэфир- ной связи между молекулой димера и

остатком янтарной кислоты. Как было показано для конъюгатов 2 -0-сукцината адено- зин-3 .б -циклофосфата с белком, гидролиз сложноэфирной связи и разрушение конъюгата происходит в водных растворах даже

при-20°С(5).

Целью изобретения является новый конъюгат аденилил(2-5)аденил ил(2|-5у-2|,З1- 0-(2-карбоксиэтил)этилиденаденозина и БСА, более стабильный в сравнении с описанными в литературе.

Поставленная цель достигается конъюгатом 1, который получают взаимодействием аденилил(2-5)аденилил (21- 5|)-2|,3|-0-(2-карбоксиэтил)этилиденаденозина

(6) с БСА в присутствии N-этил-М -диэтила- минопропилкарбодиимида в среде уксусной кислоты или натрийацетатного буфера с последующим выделением и очисткой конъюгата известными способами.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

К раствору 10 мг БСА в 1 мл воды

добавляют 10мг(0,007ммоль)аденилил(2- 51) аденилил (21-51) -21,31-0-(2- карбоксиэтил) этилиденаденозина три (триэтиламмоние- вой) соли и 7 мг (0,036 ммоль} IM-этил-М -диэ- тиламинопропилкарбодиимида гидрохлорида. К полученному раствору добавляют по каплям 1 М раствор уксусной кислоты до рН 4,5 и выдерживают смесь в течение 20 ч при комнатной температуре. Раствор диализу- ют при 0-5°С против воды (3x500 мл) и хро- матографируют на колонке с сефадексом G-10 (200 см3). Продукт элюируют водой. Фракции, содержащие конъюгат, собирают и лиофилизуют. Получают 10 мг конъюгата, УФ-спектр а воде: Лмакс 260 нм.

Степень посадки антигена на белок в полученном конъюгате, определенная спек- трофотометрически, составляет 5 моль три- мера на 1 моль белка.

П ри м б р 2.

К раствору 30 мг БСА в 3 мл 0,1 М натрий- ацетатного буфера с рН 4,7 добавляют 44 мг (0,033 ммоль) аденилил(2|-5)аденилил(2|-5|)- 2 -з -0-(2-карбоксиэтил)этилиденаденозина три(триэтиламмониевой соли) и 30 мг (0,11 ммоль) Ы-этил-Г -диэтиламинопропилкар- бодиимида гидрохлорида, Реакционную смесь выдерживают в течение 20 ч при комнатной температуре, диализуют при 0-5°С против 0,01 М натрий-фосфатного буфера с рН 7,35, содержащего 0,15 М NaCI (4 х 500 мл) и хроматографируют на колонке с сефадексом G-10 (300 см3), Продукт элюируют водой. Фракции, содержащие конъюгат, собирают и лиофилизуют, Получают 32 мг конъюгата, УФ-спектр в Н20: Амакс 260 нм. Степень посадки антигена на белок в полученном конъюгате, определенная спектро- фотометрически, составляет 8 мольтримера на 1 моль белка.

Конъюгат получают с высоким выходом (практически количественный) и хорошей степенью посадки антигена (5-8 моль три- мера на 1 моль белка), что обусловлено стабильностью соединения как в процессе синтеза так и в процессе выделения, протекающих в водных растворах. Синтезированный конъюгат используют для получения антител, специфичных к 2,5 -олигоаденила- там, что подтверждается следующим примером.

Пример 3.

Пять кроликов (случайной породы, массой 2,3-2,5 кг) иммунизируют введением 0,5 мл эмульсии 0,25 мг конъюгата 1 в полном адъюванте Фрейнда подкожно в 4-5 точек на спине 7 раз с интервалом в 14 дн. Спустя 1,5 мес. после последней инъекции проводят 5 поддерживающих инъекций с интервалом в 14 дн. и через 10 дн. проводят забор

крови. Антисыворотку выделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин, разбавляют 1:100 0,05 М ацетат-цит- ратным буфером рН 6,2-6,3 и хранят малыми аликвотами при -20°С.

Высокоспецифичная антисыворотка к аде- нилил (2-5)аденилил(2-5)аденозину была получена от двух животных через 3 мес. Характеристика антисыворотки. Путем последовательных разведений

установлено, что 50%-ное связывание радиоактивно меченного лиганда достигается при разведении 1:6000. Константа ассоциации, определенная путем построения графика Скэтчарда(7), составляет 1,18 х 109

Кроссреактивность антисыворотки к адено- зину, аденозин-б -монофосфату, аденозин- б -трифосфату 0,01%и

аденилил(3-5|)аденилил(3|-5|)аденозину составляет 0,02%.

Конъюгат, не содержащий в своей структуре лабильных сложноэфирных связей, получают и выделяют с количественным выходом. Достигаемая степень посадки гап- тена на белок обеспечивает необходимую

иммуногенность для получения антител, специфичных к 2|,5|-олигоаденилатам. Кол- нъюгат стабилен в водных растворах и может быть использован для иммунизации без дополнительной очистки после длительного

хранения.

Формула изобретения Конъюгат аденилил(2-51)аденилил- (2-5)аденозина с бычьим сывороточным альбумином формулы:

)1Нг

,

%

НО 0-Р-О

1 ПМе

ф

НО 0-Р-О

о

50

где

О О НзС СгНц-С-КН-®

55

используемый для получения антител, специфичных к 2,5 олигоаденилатам.

Похожие патенты SU1735307A1

название год авторы номер документа
ДИНАТРИЕВАЯ СОЛЬ J -МЕЧЕНОГО АДЕНИЛИЛ(2` - 5`) АДЕНИЛИЛ(2` - 5`) АДЕНОЗИНТИРОЗИНА МЕТИЛОВОГО ЭФИРА В КАЧЕСТВЕ ЛИГАНДА ДЛЯ РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ 2`,5`-ОЛИГОАДЕНИЛАТОВ 1990
  • Квасюк Е.И.
  • Макаренко М.В.
  • Кулак Т.И.
  • Шуляковская С.М.
  • Михайлопуло И.А.
SU1746684A1
Ди(триэтиламмониевая)соль аденилил(2 @ -5 @ )-аденилил(2 @ -5 @ )аденозин-тирозин метилового эфира в качестве промежуточного соединения в синтезе 125J-меченого 2 @ ,5 @ -олигоаденилата 1990
  • Квасюк Евгений Иванович
  • Кулак Тамара Ивановна
  • Шуляковская Светлана Михайловна
  • Михайлопуло Игорь Александрович
  • Макаренко Михаил Васильевич
SU1768611A1
Динатриевая соль аденилил(2 @ -5 @ ) аденилил (2 @ -5 @ )-9-(2,3-ангидро- @ - @ -рибофуранозил)аденина, обладающая фиторостостимулирующей активностью 1988
  • Квасюк Е.И.
  • Кулак Т.И.
  • Ткаченко О.В.
  • Михайлопуло И.А.
  • Ткачук З.Ю.
  • Ткачук Л.В.
  • Музыченко Б.С.
  • Кацука Г.Х.
SU1573834A1
6-N-Бензоил-9-(2 @ -0-ацетил-3- @ дезокси-3 @ -хлор- @ - @ -ксилофуранозил)аденин в качестве промежуточного соединения в синтезе динатриевой соли аденилил-(2 @ -5 @ )аденилил(2 @ -5 @ )-9-(2 @ ,3 @ -ангидро- @ - @ -рибофуранозил)аденина, обладающей фиторостостимулирующей активностью 1988
  • Квасюк Е.И.
  • Кулак Т.И.
  • Ткаченко О.В.
  • Михайлопуло И.А.
SU1573833A1
КОНЪЮГАТ ОКСИТЕТРАЦИКЛИНА С БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ ДЛЯ ИММУНОХИМИЧЕСКОГО СПОСОБА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКСИТЕТРАЦИКЛИНА 2003
  • Комаров А.А.
  • Вылегжанина Е.С.
  • Панин А.Н.
RU2243235C1
Способ получения моноспецифических антител к лактоферрицину человека 2022
  • Коханов Александр Владимирович
  • Луцева Оксана Алексеевна
  • Голубкина Светлана Александровна
  • Сайдулаев Ваха-Хажи Алиевич
  • Мулдашева Наиля Гамиловна
RU2795322C1
N-ОКСИСУКЦИНИМИДНЫЕ ЭФИРЫ N-АЦЕТИЛТИРОНИНОВ В КАЧЕСТВЕ ПОЛУПРОДУКТОВ ДЛЯ СИНТЕЗА КОНЪЮГАТОВ ТИРЕОИДНЫХ ГОРМОНОВ С АЛЬБУМИНОМ 1983
  • Матвеенцев В.Д.
  • Свиридов О.В.
  • Стрельченок О.А.
  • Ахрем А.А.
SU1100846A1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА АЙМАЛИНА С БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ 1993
  • Бабкина С.С.
  • Винтер В.Г.
  • Зайнуллина А.С.
RU2088230C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА КАТЕХОЛАМИНОВ 1991
  • Казак Л.Е.
  • Маслин Д.Н.
  • Большакова Т.Д.
RU2027443C1
Способ получения аффинных сорбентов для иммуноферментного анализа 1989
  • Карасева Елена Николаевна
  • Маркина Вера Леонидовна
  • Еремин Александр Николаевич
  • Метелица Дмитрий Иванович
SU1700006A1

Реферат патента 1992 года Конъюгат аденилил(2 @ -5 @ ) аденилил-(2 @ -5 @ ) аденозина с бычьим сывороточным альбумином, используемый для получения антител, специфичных к 2 @ , 5 @ - олигоаденилатам

Изобретение относится к биохимии, конкретно к конъюгату аденилил(21-51)аде- нилил (21-51) аденозина с бычьим сывороточным альбумином. Цель изобретения - повышение стабильности. Конъюгат получают взаимодействием адёнилил (21-51) аденилил (21-51)-21, 31-0-(2-карбоксиэ- тил/этилиденаденозина с бычьим сывороточным альбумином в присутствии М-этил-М1-диэтиламинопропилкарбодиими - да в среде водной уксусной кислоты или на- трийацетатного буфера. Полученный конъю- гат стабилен в водных растворах и может быть использован для получения антител, специфичных к 2 ,5 -олигоаденилатам. Ё VJ GJ ел со о VI

Формула изобретения SU 1 735 307 A1

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1992 года SU1735307A1

Кегг I
М., Brown R
Е., рррА21р51 А2 р51А, an inhibitor of protein synthesis synthesied with en ензуте fraction from interferottreated cells //Proc
Natl
Acad
Sci
USA
Кинематографический аппарат 1923
  • О. Лише
SU1970A1
Фальцовая черепица 0
  • Белавенец М.И.
SU75A1
Ножевой прибор к валичной кардочесальной машине 1923
  • Иенкин И.М.
SU256A1
Kimehi A., Shere H., Revel M
Regulation of lymphocyte mitogenesis by () digo- isoadenylate //Nature (London)
Дверной замок, автоматически запирающийся на ригель, удерживаемый в крайних своих положениях помощью серии парных, симметрично расположенных цугальт 1914
  • Федоров В.С.
SU1979A1
Приспособление для усиления тяги в дымоходах и вытяжных каналах 1925
  • Лавров Н.С.
SU849A1
Knight M
Wreschner D
H., Silverman R
H., Kerr I
M
Выбрасывающий ячеистый аппарат для рядовых сеялок 1922
  • Лапинский(-Ая Б.
  • Лапинский(-Ая Ю.
SU21A1
Приспособление для изготовления в грунте бетонных свай с употреблением обсадных труб 1915
  • Пантелеев А.И.
SU1981A1
Цилиндрический сушильный шкаф с двойными стенками 0
  • Тринклер В.В.
SU79A1
Приспособление для подвешивания тележки при подъемках сошедших с рельс вагонов 1920
  • Немчинов А.А.
SU216A1
Cailla H., Laurence L, Le Borgne, De Kaouel C., Roux D., Marti J
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
Med
Proc
Int
Symp
Выбрасывающий ячеистый аппарат для рядовых сеялок 1922
  • Лапинский(-Ая Б.
  • Лапинский(-Ая Ю.
SU21A1
Приспособление для установки двигателя в топках с получающими возвратно-поступательное перемещение колосниками 1917
  • Р.К. Каблиц
SU1985A1
Устройство для видения на расстоянии 1915
  • Горин Е.Е.
SU1982A1
Способ сопряжения брусьев в срубах 1921
  • Муравьев Г.В.
SU33A1
Carter M
C., Meyerhoff M
E
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
Immunol
Methods
Приспособление для установки двигателя в топках с получающими возвратно-поступательное перемещение колосниками 1917
  • Р.К. Каблиц
SU1985A1
Горный компас 0
  • Подьяконов С.А.
SU81A1
Льночесальная машина 1923
  • Чепуль Э.К.
SU245A1
Kvasyuk E
I., Kulak T
I., Laitseva G
V., Miklailopulo I
A., Charubala R., Pfleiderer W
Лыжа для самолета 1924
  • Шторм А.Ю.
SU2151A1
Видоизменение пишущей машины для тюркско-арабского шрифта 1923
  • Мадьяров А.
  • Туганов Т.
SU25A1
САМОЦЕНТРИРУЮЩИЙ ПАТРОН ДЛЯ ТОКАРНЫХ СТАНКОВ 1924
  • Колосов М.П.
SU3683A1
Чард Т
Радиоиммунологические методы
М.: Мир, 1981, с
Деревянная повозка с кузовом, устанавливаемым на упругих дрожинах 1920
  • Ливчак Н.И.
SU248A1

SU 1 735 307 A1

Авторы

Кулак Тамара Ивановна

Квасюк Евгений Иванович

Михайлопуло Игорь Александрович

Шуляковская Светлана Михайловна

Прядко Андрей Георгиевич

Карпова Татьяна Владимировна

Даты

1992-05-23Публикация

1990-07-02Подача