Изобретение относится к биохимии, конкретно к конъюгату формулы I:
шW
но
л
Y7l
Ade
н-SX
W
БСА.-5ыч1ш сыбороточный альбумин ,
который может быть использован для получения антител, специфичных к 2 ,5-олиго- аденилатам.
2|,5|-Олигоаденилаты - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которые являются медиаторами противовирусного действия интерферона (1). Эти соединения присутствуют в различных органах и тканях и обладают широким спектром биологической активности (2). Концентрация 2,5 -оли- гоаденилатов в клетках зависит от гормонального статуса организма и уровня циклических нуклеотидов. Это свидетельствует о возможности использования 2, олигоаденилатов в качестве лекарственных препаратов, а также для создания на их основе средств микроанализа для диагностики различных заболеваний (вирусные, аллергические, аутоиммунные и т.д.).
Широкое распространение для определения природных соединений в биологических объектах получили методы, основанные на использовании антител, специфичных к этим соединениям. 2,5 -Олиго- аденилаты сами по себе не обладают иммуногенностью, поэтому для получения иммунного ответа у животных они могут быть использованы для иммунизации в виде конъюгатов с белками. Так как в общем пуле 2,5 -олигоаденилатов в клетке основная доля приходится на тример, то естественно, что конъюгаты должны быть получены на его основе.
Известен конъюгат аденилил(2-5)аде- нилил(2-5)аденозина с БСА формулы:
пАйе
T7I
НО 0-Р-О 0-1/0
Ade
W
НО 0-Р-О
i-vQ|ue
®-W чшв котором связь тримера с белком осуществляется путем периодатного окисления, 2,з -цис-диольного фрагмента 2 -терми- нального аденозина с последующими конденсацией образующегося диальдегида с аминогруппами белка и восстановлением Шиффовых оснований (3). Такой способ получения в данном случае приводит практически к разрушению одного звена в молекуле
антигена, что не может не сказаться на специфичности вырабатываемых животным антител.
Более близким по сути к предлагаемому является конъюгат формулы:
Ho-yONMe
W §
НО Q-P-Qi-jAf
@Н1н-с-снг-снгс-о о-8-снгснгс-кн-©
Полученный путем конденсации 0-сукципильного производного аденилил-(2 -5)аде- нозина с БСА (4). Существенным недостатком такого конъюгата является наличие в молекуле лабильной сложноэфир- ной связи между молекулой димера и
остатком янтарной кислоты. Как было показано для конъюгатов 2 -0-сукцината адено- зин-3 .б -циклофосфата с белком, гидролиз сложноэфирной связи и разрушение конъюгата происходит в водных растворах даже
при-20°С(5).
Целью изобретения является новый конъюгат аденилил(2-5)аденил ил(2|-5у-2|,З1- 0-(2-карбоксиэтил)этилиденаденозина и БСА, более стабильный в сравнении с описанными в литературе.
Поставленная цель достигается конъюгатом 1, который получают взаимодействием аденилил(2-5)аденилил (21- 5|)-2|,3|-0-(2-карбоксиэтил)этилиденаденозина
(6) с БСА в присутствии N-этил-М -диэтила- минопропилкарбодиимида в среде уксусной кислоты или натрийацетатного буфера с последующим выделением и очисткой конъюгата известными способами.
Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1.
К раствору 10 мг БСА в 1 мл воды
добавляют 10мг(0,007ммоль)аденилил(2- 51) аденилил (21-51) -21,31-0-(2- карбоксиэтил) этилиденаденозина три (триэтиламмоние- вой) соли и 7 мг (0,036 ммоль} IM-этил-М -диэ- тиламинопропилкарбодиимида гидрохлорида. К полученному раствору добавляют по каплям 1 М раствор уксусной кислоты до рН 4,5 и выдерживают смесь в течение 20 ч при комнатной температуре. Раствор диализу- ют при 0-5°С против воды (3x500 мл) и хро- матографируют на колонке с сефадексом G-10 (200 см3). Продукт элюируют водой. Фракции, содержащие конъюгат, собирают и лиофилизуют. Получают 10 мг конъюгата, УФ-спектр а воде: Лмакс 260 нм.
Степень посадки антигена на белок в полученном конъюгате, определенная спек- трофотометрически, составляет 5 моль три- мера на 1 моль белка.
П ри м б р 2.
К раствору 30 мг БСА в 3 мл 0,1 М натрий- ацетатного буфера с рН 4,7 добавляют 44 мг (0,033 ммоль) аденилил(2|-5)аденилил(2|-5|)- 2 -з -0-(2-карбоксиэтил)этилиденаденозина три(триэтиламмониевой соли) и 30 мг (0,11 ммоль) Ы-этил-Г -диэтиламинопропилкар- бодиимида гидрохлорида, Реакционную смесь выдерживают в течение 20 ч при комнатной температуре, диализуют при 0-5°С против 0,01 М натрий-фосфатного буфера с рН 7,35, содержащего 0,15 М NaCI (4 х 500 мл) и хроматографируют на колонке с сефадексом G-10 (300 см3), Продукт элюируют водой. Фракции, содержащие конъюгат, собирают и лиофилизуют, Получают 32 мг конъюгата, УФ-спектр в Н20: Амакс 260 нм. Степень посадки антигена на белок в полученном конъюгате, определенная спектро- фотометрически, составляет 8 мольтримера на 1 моль белка.
Конъюгат получают с высоким выходом (практически количественный) и хорошей степенью посадки антигена (5-8 моль три- мера на 1 моль белка), что обусловлено стабильностью соединения как в процессе синтеза так и в процессе выделения, протекающих в водных растворах. Синтезированный конъюгат используют для получения антител, специфичных к 2,5 -олигоаденила- там, что подтверждается следующим примером.
Пример 3.
Пять кроликов (случайной породы, массой 2,3-2,5 кг) иммунизируют введением 0,5 мл эмульсии 0,25 мг конъюгата 1 в полном адъюванте Фрейнда подкожно в 4-5 точек на спине 7 раз с интервалом в 14 дн. Спустя 1,5 мес. после последней инъекции проводят 5 поддерживающих инъекций с интервалом в 14 дн. и через 10 дн. проводят забор
крови. Антисыворотку выделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин, разбавляют 1:100 0,05 М ацетат-цит- ратным буфером рН 6,2-6,3 и хранят малыми аликвотами при -20°С.
Высокоспецифичная антисыворотка к аде- нилил (2-5)аденилил(2-5)аденозину была получена от двух животных через 3 мес. Характеристика антисыворотки. Путем последовательных разведений
установлено, что 50%-ное связывание радиоактивно меченного лиганда достигается при разведении 1:6000. Константа ассоциации, определенная путем построения графика Скэтчарда(7), составляет 1,18 х 109
Кроссреактивность антисыворотки к адено- зину, аденозин-б -монофосфату, аденозин- б -трифосфату 0,01%и
аденилил(3-5|)аденилил(3|-5|)аденозину составляет 0,02%.
Конъюгат, не содержащий в своей структуре лабильных сложноэфирных связей, получают и выделяют с количественным выходом. Достигаемая степень посадки гап- тена на белок обеспечивает необходимую
иммуногенность для получения антител, специфичных к 2|,5|-олигоаденилатам. Кол- нъюгат стабилен в водных растворах и может быть использован для иммунизации без дополнительной очистки после длительного
хранения.
Формула изобретения Конъюгат аденилил(2-51)аденилил- (2-5)аденозина с бычьим сывороточным альбумином формулы:
)1Нг
,
%
НО 0-Р-О
1 ПМе
ф
НО 0-Р-О
о
50
где
О О НзС СгНц-С-КН-®
55
используемый для получения антител, специфичных к 2,5 олигоаденилатам.
Изобретение относится к биохимии, конкретно к конъюгату аденилил(21-51)аде- нилил (21-51) аденозина с бычьим сывороточным альбумином. Цель изобретения - повышение стабильности. Конъюгат получают взаимодействием адёнилил (21-51) аденилил (21-51)-21, 31-0-(2-карбоксиэ- тил/этилиденаденозина с бычьим сывороточным альбумином в присутствии М-этил-М1-диэтиламинопропилкарбодиими - да в среде водной уксусной кислоты или на- трийацетатного буфера. Полученный конъю- гат стабилен в водных растворах и может быть использован для получения антител, специфичных к 2 ,5 -олигоаденилатам. Ё VJ GJ ел со о VI
