СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Советский патент 1973 года по МПК C12N9/24 

1

Изобретение относится к микробиологии.

Известен способ получения литических ферментов путем выращивания их продуцентов на нитателыюй среде, содержащей источники углерода и азота в присутствии минеральных солей с последующим выделением ферментов из культуральной жидкости.

Для повышения активности ферментов в качестве продуцента используют микроорганизмы рода Micromonospora.

Из рода Micromonospora используют микроорганизм вида vulgaris.

В качестве продуцента из вида используют штамм Micromonospora vulgaris РА-11-4.

В качестве источника углерода и азота для данного щтамма используют кукурузную муку с л;обавлением к ней сухих кормовых дрожжей.

Термофильный актиномицет Micromonospoга vulgaris РА-11-4 выделен из содержимого рубца крупного рогатого скота (проба рубцовой жидкости привезена из Ашхабада).

Характеристика Micromonospora vulgaris РА-11-4. Морфология. Мицелий несептированный, тонкий. На гифах формируются одиночные споры диаметром 0,5-0,7 мк. Споронощение обилыюе. Споры имеют округлые очертания и полигональную форму. Оболочка спор гладкая.

Культуральные признаки. Рост на органических средах. Крахмально-казеиновая среда. При 27°С роста нет. При 35°С и 65°С рост очень слабый. Рост хороший при 50-60°С. Шестисуточные колонии нри 55°С с диаметром 5,0-8,5 см плоские, с мелкими радиальными складками, светло-бурые, центр колонии несколько приподнят. Нижняя сторона колоний окрашена в желтовато-бурый или охряпо-бурый цвет. Пигмент в среду не выделяется. Воздушный мицелий белый, мучнистый или тонковолокнистый.

Сусло-агар - нет роста. Ломтики картофеля - нет роста, но на 20%-ном картофельном отваре рост культуры хороший. МПА - рост хороший. Колонии кожистые, плоские, вросшие в агар. Нижняя сторона колоний буроватая. Среда не пигментирована. Воздушный мицелий белый, мучнистый.

Рост на синтетических средах - CPI, СРП1, среда Чапека-Докса - слабый. На специально подобранной среде с глюкозой рост хороший. Колонии бесцветные или буроватые. Нижняя сторона колонии желтовато-бурая. Воздушный мицелий белый. Среда не пигментирована.

Физиолого-биохимические свойства. Желатину разжижает. Крахмал гидролизует. Молоко коагулирует, пептонизирует. Нитраты не восстанавливает. К.гтетчатку не разлагает.

Из источников углерода хорошо усваивает глюкозу, крахмал, декстрин, глицерин, мальтозу, маннит и фруктозу. Хуже усваивает лимоннокислый и яблочнокислый натрий. Нет роста на средах с арабинозой, галактозой, ксилозой, лактозой, рамнозой, сахарозой, маннозой, инулииом, инозитом, дульцитом, натриевыми солями уксусной, ндавелевой, янтарной и инровиноградной кислот.

Из минеральных источников азота усваивает KNOs в сочетании с (NH4)2SO,t, ио каждую из этих солей в качестве единственного источника азота илохо исиользует.

Из органических источников азота лучше всего усваивает иентои, хуже асиарагии, глицин, мочевину. Не усваивает аланин как единственный источник азота.

Культура обладает очень слабой антибиотической активностью.

В лабораторных условиях культивирование Misromonospora vulgaris РА-11-4 ироводят глубинным сиособом (на качалке с 200- 250 об/мин) в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл с 50 мл питательной среды.

Состав среды следующий, г/л:

Кукурузная мука20

Кормовые дрожжи (сухие)5

(N,H4)2S041

СаСОз1

В среде водопроводной воды находится до 1 л; рН среды иосле стерилизации 7,0-7,2. Температура культивирования 45-50°С. Длительность культивирования 48 час.

Реакционная смесь без фермента ОД реакционной смеси с ферментом

ОД через время tчерез время t

ОД реакционной смеси без фермента через время t

Спектр действия препарата литических ферментов Micromonospora vulgaris РА-11-4 представлен в таблице.

Клетки грампололсительных и грамотрицательных бактерий растворяются как мертвые, так и живые, причем последиие характеризуются наибольшей степенью чувствительности. Из испытанных 12 видов грамотрицательиых бактерий легче всего лизировались клетки Е. соИ, Proteus vulgaris, Pseudomonas bluoresens, Aerobacter cloacea.

Суспензии мертвых клеток указанных бактерий нри инкубации с ферментным препаратом в конечной концентрации 0,01% просветлялись на 100% за 10 мин, а суспензии живых клеток - за 30 мни нри концентрации более высокой - 0,025%. Живые клетки других грамотрицательных бактерий: Aerobacter aerogenes. Vibrio costicolus некоторых видов рода Hydrogenomonas лизировались на 60-90% при инкубации в течение 1-2 час или более при 0,025% концентрации ферментного иренарата.

В качестве носевного материала иснользуют сиоровую суспензию Micromonospora vulgaris РА-11-4, выраш,енного на агаризоваииой среде указанного выше состава.

Характеристика спиртового препарата

литических ферментов Micromonospora

vulgaris РА-П-4.

Литические ферменты в виде технического

препарата получают путем выделения их (при охлаждении) из центрифугата культуральиой жидкости осаждением этиловым сииртом в соотиошенин 1 ; 4 (ио объему). Выход препарата составляет в среднем 3 г/л. О качестве

ферментного иреиарата судим по литической активности, определяемой по изменению онтической плотности суспензии испытуемых микроорганизмов и но иротеолитической активности, определяемой по методу Номото и

Нарахаши в модификации Каверзневой и Рассулина.

При определении литической активности 4,5 мл суспензии мертвых или живых клеток испытуемых микроорганизмов (с начальным ОД 0,5-1,0, что соответствует 8-16 мг но сухому весу) в 0,025-метровом фосфатном буфере с рН 8,0 с 0,5 мл 0,1% или 0,25%-ного раствора ферментного препарата в том же буфере инкубировали при 60°С. Гидролиз проводили в пробирках, помешенных в ультратермостат. Оптическую плотность измеряли в пробирках на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 мм. В качестве контроля на автолиз брали ту же суспензию клеток испытуемых микроорганизмов и буфер вместо фермента. Коэффициент у.меньшеиия мутности рассчитывается по формуле (в %);

100

Но отношению к клеткам грамположительных бактерий действие препарата литических

ферментов Micromonospora vulgaris РА-11-4 было менее эффективным: за 30 мин - 1 час степень их лизиса составляла 20-40% и не увеличивалась при более продолжительном времени инкубации.

Еше большая устойчивость к лизису наблюдалась у организмов рода Mycobacterium, Brevibacterium и Corynebacterium. Исключение составляла культура Mycococcus lactis, выраженная на среде с н-парафинами, лиофильно-высушенные клетки которой лизировались на 94% при пятнадцатиминутной инкубации с ферментным препаратом в концентрации 0,01%, а живые клетки - на 50% через 1 час.

Из дрожжей были испытаны Candida tropicalis и С. guilliermondii, вырашенные в средах с углеводородами. Степень лизиса мертвых клеток дрожжей составляла 50-60% при инкубации с ферментным препаратом в течение

1 час, а живых - 3 час.

Спектр действия литических ферментов термофильного актиномицета Micronionospora Vulgaris РА-11-4

Бактерии грамотр

Escherlchla соИ 125 мертвые клетки живые клетки

Proteus vulgarls 127 мертвые клетки живые клетки

Pseudomonas fluorescens мертвые клетки живые клетки

Aerobacter cloacea А-30 живые клетки

Aerobacter aerogenes 906 мертвые клетки живые клетки

Serratla marcescens живые клетки

Vibrlocosticolus живые клетки

Alcallgenes sp. живые клетки

Hldrogenomonas rullandti живые клетки

Hldrogenomonas sp. 17549 живые клетки мертвые клетки

Hidrogenomonas eutropha живые клетки

Hltlrogenomonas sp. 17716 живые клетки

Бактерии грампол

MIcrococcus lysodelktlcus мертвые клетки живые клетки

Micrococcus denltilflcans живые клетки

Sarclna lutea 4S6 мертвые клетки

Staphylococcus aureus мертвые клетки

Bacillus megaterium 512 мертвые клетки

Вас. subillls 428 мертвые клетки

Вас. cereus 370

мертвые клетки

Вас. brevls 224

(термофильный штам живые клетки

Arthrobacier cltreus 654 мертвые клетки живые клетки

Другие микроо

Mycococcus lactis 41 мертвые клетки живые клетки

Предмет изобретения

8

П р о д о л ж е н и е

штамм Micromonospora vulgaris РА-11-4.

муку с добавлением к ней сухих кормовых дрожжей.