Способ определения фагоцитарной активности клеток крови Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в иммунологии. Известен метод исследования фагоцитарной активности клеток путем инкубации лейкоцитов крови человека с культурой стафилококков с .последующим визуальным подсчетом в микроскоп количества поглсяценных лейкоцитами микроорганизмов {. Известен также способ определения фагоцитарной активности клеток крови путем инкубирования суспензии лей коцитов с фагоцитируемым агентом, представляющий собой микроорганизма, меченные € С2 . Недостатком известных спосрбов .яв ляется невозможность использованияи Для определения фагоцитоза растворимых белковых агрегатов. Цель изобретения - одновременное измерение связывания и поглощения клетками крови растворимых белков, , Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения фагоцитарной активности клеток крови путем инкубирования суспензии лейкоцитов с фагоцитируемым агентом в качестве фагоцитируемого агента исполь зуют ,.1-гамма-глобулин, агрегированный прогреванием при 60-63 и рН 7,2-7 ,3, затем полученный агрегат инкубируют с суспензией клеток в течение 2-3 ч при Зб-37 с, после чего его делят на две пробы, одну из кото рых отмывают физ,иологическим раствором и определяют ращйометрически сум марное количество присоединенного белка, другую - обрабатывают 0,2-0,3 ным раствором трипсина и определяют количество поглощенного белка,, по от ношению поглощенного и присоединенного белка определяют фагоцитарную активность клеток. Способ осуществляют следующим об разом.. Фракцию 11 Кона (гамма-глобулин) растворяют в .0,1 М фосфатном буфере рН 7,2-7,3 из расчета 5 кг/мл и агр гируют прогреванием на водяной бане при 60 в течение 40 мин. После этого раствор центрифугируют 30 мин при 7000 об/мин. Используют надосадочную , фракцию, в которой концентрацию белка определяют по Лоури. . Агрегированный гамма-глобулин метят изотопом с помощью лактоперок сидазного метода.Для этого 25 мкг бел ка при концентрации 1 мг/мл разводят в 30 мкл 0,3 М фосфатного буфера рН 7,после чего добавляют 1 мкл раствора лактопероксидазы (1 мг фермента, 1 мл ЗМ фосфатного буфера, 1 мл глицерина) , 450 мкКи I и 10 мкл 0,88 мМ раствора перекиси водорода. После инкубации в течение 10 мин при 20 вновь добавляют 10 м,кл 0, раствора перекиси водорода, инкубируют 5 мин при 20и останавливают реакцию добавлением 0,5 мл 10 мМ раствора дитиотриэтола. Через 10 мин несвязанный изотоп отделяют от связанного с белком фильтрацией на сефадексе Г-25. Меченный белок разводят немеченным агрегированным гаммаглобулином из расчета 50000 имп/мин на 5 мкг белка в 20 мл- фосфатного буфера . Кровь от донора в количестве 10 мл берут из локтевой вены в пробирку с гепарином (25 ед. гепарина на 1 мл крови). После отстаивания эритроцитов плазму с лейкоцитарной массой центрифугируют при 1500 об/мин 5 мин. Оставшиеся в осадке эритроциты лйзируют 0,86%-ным раствором хлористого аммония, а лейкоциты трижды отмывают раствором Хенкса и доводят до концентрации 4«10 клеток/мл среды W 199. К 0,5 мл суспензии лейкоцитов (2- 1 оклеток) добавляют 5 Мкг/20 мкл агрегированного белка (50000-имп/мин) и инкубируют B термостате при течение 2-3 ч с периодическим встряхиванием через каждые 15 мин. Всего приготавливают 6 проб с 2-10 клеток, После инкубации три пробы отмывают трижды изотоническим раствором хлористого натрия, а три другие после двукратной отмывки изотоническим раствором обрабатьтают 0,25%-ным раствором трипсина. Радиоактивность клеток после удаления недостаточной жидкости подсчитывают в гамма-сцинтилляционном счетчике и рассчитывают средние показатели для трех параллельных образцов. В таблице приведены данные, иллюстрирующие фагоцитарную активность лейкоцитов у здоровых доноров и больНЬ1Х миокардитом.

Здоровые

СНОСОВ ОНРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ. АКТИВНОСТИ КЛЕТОК КРОВИ путем инкубиробания суспензии лейкоцитов с фагоцитируеквл4 агентом, о т л и ч аю щ и и с я тем, что, с целью одно- ; временного измерения связывания и поглощения растворимых белков, 8 качестве фагоцитируемого агента используют 1-гамма-глобулкн, агрегированный прогреванием при 60-63 и рН 7,2-7,3, затем полученньт агрегат инкубируют с суспензией клеток в течение i-3 ч при 36-37 после чего его делят на две пробы, одну из которых отмывают физиологическим раствором и определяют радиометрически cyt«4apное количество присоединенного белка, другую - обрабатывают 0,2-0,3%ным раствором трипсина и определяют количество поглощенного белка, по от-( ношению поглощенного и присоединенного белка определяют фагоцитарну активность клеток.

Предложенный способ определения фагоцитарной активности клеток крови дает возможность определить способность клеток связывать и погло- JQ щать растворимые белковые вещества, что необходимо для изучения процесса элиминации из организма .иммунных комплексов. Способ позволяет уточ нить характер дефекта фагоцитарной функции клеток, что важно для выяснения цатогенеза многих заболевапий.