Способ определения эндотоксина бактерий в биологических жидкостях Советский патент 1979 года по МПК C12K1/00 G01N33/16 

1

Изобретение относится к области медицины и биологии.

Известен способ определения эндотоксина бактерий в биологических жидкостях путем воздействия биологической жидкостью на клетки макроорганизма с последующим определением количества измененных клеток I.

Однако известный способ сложен, длителен (исследование занимает около пяти суток) и не обеспечивает высокой чувствительности.

Целью изобретения является повышение чувствительности, ускорения и упрощение способа.

Для этого по предлагаемому способу биологическую жидкость вводят внутреяно в макроорганизм, отделяют nepHTOHeaflbHyw ткань, готовят монослойную культуру перитрг неальных клеток, прижизненно окрашивакп флуорохромом, oтrffeдeлnют количества-йлеток с окрашенными лизосомами и по величине лизосомного показателя определяют rf личие эндотоксина..

Способ осуществляют следующим обра.зом.

Взрослым, практически здоровым, белым мышам весом 20-25 г в хвостовую вену вводят 0,2 М.1 испытываемой биологической жидкости. Через 60 мин животных забивают путем пережатия области шеи.

Стерильно вскрывают брюшную полость и вливают туда 10 мл стерильного физиологического раствора Хенкса. В счетной камере подсчитывают количество клеток и доводят их концентрацию до 10 клеток/мл. Клеточную взвесь заливают в плексигласовые коробочки (прямоугольные контейнеры с крышками), на дне которых уложены предметные стекла, выдерживают при 37°С в течение 60 мин. После этого препараты споласкивают физио-югнческим раствором, смывая неприкрепившиеся клетки. Эти препараты на стеклах погружают в раствор красителя - акридинового оранжевого (1 : 250000,4 мкг/мл) в растворе Хенкса и инкубируют 60 мин при 37°С. По окончании флуорохромирования препараты отмывают от непоглощенного красителя, накрывают покровным стеклом и окантовывают их по краям расплавленным парафином для предохранения от высыхания.

Готовые препараты просматривают с помощью флуоросцентного микроскопа МЛ-2А с бинокулярной насадкой в отраженном свете при увеличении. Количественный учет клеточной реакции.н токсическое воздействие осуществляют путем подсчета в препаратах :не менее 00 клеток в разных полях зрения. Из этого количества определяют процент .luie- ток, в цитоплазме которых выявлялись четко выраженные лизосомы - яркокрасные образования на бледнозелетом фоне цито плазмы. Подсчет производят в трех-четырех параллельно приготовленных препаратах Данные испытания способа показали, что у здоровых животных в контрольных проба:., где вместо эндотоксина был введен такой же объем (0.2 мл стерильного физиологического раствора Хенкса, количество loreток с выявляемыми лизосомами не превышало 20-25%. Нахождение таких клеток до относится к норме.

При наличии в исследуемой жидкости эндотоксина и при введении его животному в количестве 10 мкг, в том же объеме жидкости, содержание клеток с лизосомами, окрашенными акридиновым оранжевым, превышает 50 - 55°/о, а при введении 5 мкг эндотоксина на мышь лизосомный показатель превышает 30 - 35%.

Установление лизосомного показателя выше 30%, после внутривенного введения мышам испытуемой пробы с ггодозрением на

эндотоксин, считается положительным, т.е. говорит о наличии эндотоксина.

Предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью, сокращает время определения вместо 5 дней до 3,5 - 4 ч и не требует сложного оборудования и наличияспециальной лаборатории клеточных культу

Формула изобретения

Способ определения эндотоксина бактерий в биологических жидкостях путем воздействия биологической жидкостью на клетки макроорганизма с последующим определением количества измененных клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности, ускорения и упрощения способа, биологическую жидкость вводят в макроорганмзм, отделяют пери-тонеальную .ткань, готовят м6кослой 1ую культуру перитонеальиых , прижизненно окрашивают флуорохромом, затем определяют количество-клеток с окрашенными лизосомами и по величине лизосомиого показателя определяют наличие эндотоксина.

Источьшки информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Аркадьева Г. Е. «Действие бактериальных токсинов на клетки организма и некоторые механизмы их детоксикации.Автореферат диссертации, Л., 1963.