Способ получения водорастворимых комплексов ферментов класса оксидоредуктаз Советский патент 1979 года по МПК C07G7/02 

. Изобретение относится к способу получения иммобилизованных ферментов, а именно к способу получений иммобилизованных на водораствори ,мых полимерах Ферментов класса оксидоредуктаз, которые могут, бкть использованы в проточных реакторах мембранного и колоночного, типа, а также в автоматических амалй:зат6ра;х биологичес1сих объектов. Стабильные ферментные препараты, иммобилизован ные таким способом могут найти применёние в медицинской и пищевой промыголенности, в тонком органическом синтезе, при создании преобразоваг телей химической .энергии в электрическую, а также в охране окружающей среды.у : ., . Известно, что иммобилизация фер.ментов на различных твердых носителях, а также образование комплексов с водорастворимыми полимерами позволяет увеличить продолжительность действия ферментов .и обеспечивает их технологичность 1. Особые трудноети при иммобилизации встречаются ;в работе с оксидоредуктазами (например оксид азами метанола, глюкозы, .различными видами дегидрогеназ). Нестабильность этих ферментов в иммо билизовавном состоянии затрудняет разработку способов их использования в ргазличных областях .народного хрзяйства. -.; ; .. .. .-. В настоящее время одним из. основных способов получения иммобилизован:ных Фермё.нтбв, в частности оксидоредуктаз, является.их пришивка к носителя ,:сЪДШйс аЩим свободные альдегидные группы. При этом происходит образование .ковалёнтной. связи между свобрднымиаминогруппами фермента или его сульфгидрильныз щ.. группами и альдегидны шгруппами носителя. Важнейшей хара;ктеристикой приготовленных таким способом ферментов является ве,личина остаточной активности и стабильность. Как правило, происходит значительное падение активности, а стабильность иммобилизованных ферментов повышается. Абсолютные значения этих величин зав.исят от вида используемых носителей и ферментов. Известен спо.соб получения иммобилизованнБК ферментов, когда в-ка честве водонерастворимого носителя используют сополимеры диметилацеталя N-акриламиноацетальдёгида и N,N-Meтиленбисакриламида 2. . Недостатком указанного способа ;йвйяется зйачйтёлБЙая потеря йКтЙвности ферментов при иммобилизаций. Так, в случае трипсина сохраняет 25% начальной активности, а при иммобили зации off -амилазы эТа величина составляет всего лишь 1-4%. Из других полимеров, содержаших свободные альдегидные , следует.ртметить сополимеры стирола и акрилового альдегида 13, а также сополимеры винилиновых эфиров,акриловой кислоты - вакрил и ко:Ванакрил 4 Недостатком указанных методов является большая потеря активности фермент,а при его иммобилизации, достигающая в некоторых случаях 90 j% и более. Кроме того, стабильность фермент.а часто лишь незначительно возрастае;т при .такого рода иммобилизаЦии.. . . Известен также способ получения водорастворимых комплексов фермецтов класса оксидоредуктаз, в частное ти глюко 3 ооксида зы, з аключанлцийся в обработке раствора фермента растворами водораство И1 ь с полимеров: поливинилпирролидона, ifibnH-; ; эт,иленоксида, сополимера йинилпирролидона и винйлацетата 5. Полученные таКим образом комплексы фёрмента с полимером сохраняют высокую. . начальную активность (до 90%), одна ко стабильность их лишь в 2-3 превышает стабильность нативйвк ферментов. Кроме того, отсутствие кова лентных связей между молекулами фермейта и полимером делает образовавшиеся комплексы непрочными и не по воляёт эффективно исйЬл1 Эбьат 3ty. в технологических процессах. . Целью описываемого способа Является Ьовышение стабильности фермёйто с /одновременным сохранением высокого уровня ферментативной активности Указанная цель достигается за счет того, что в качестве водорас1вс Е)Имой полимерной подложки для иммобил зации ферментов класса оксйдо ёйр таз используют кватернизованные сии тетическйе в;одораствори1фге полимеры на основе 4-винилпиридина и акролеи на/содержащие альдегидные группы, . qnoco6HHe взаимоДействова ть с сульф гаДрильными и аминогруппами фермёйтов с образованием прочного ковален ного кЪмплекса Фермента с полимером Согласно изобретению описывается Способ получения водорастворимого Комплекса ферментов класса оксидоре дуктаз с повышенной стабильностью , и высокимй. качествами в смысле технолргйчйости использования полученных препаратов путем обработки ферментов водорастворимым кватернизованны сополимером акролеина с 4-винилпири нрм, содержащим альдегидные группы. 74. Процесс получения тлмобилизованных описываемым способом-препаратов является двухстадийным и его проводят предпочтительно следующим образом. 1.Получают водорастворимый полимер, являющийся сополимером акролеина и 4-винилпиридина. Эти сополимеры могут содержать 5-30% акрсетеивовых звеньев. Для придания этим полимерам растворимости в воде их кватернйэi oт любым алкилируюпщм агентом, йапример диметилсульфатрм. Степень кватернизац1ии можно варьировать от 20 до 95% пиридиновых звеньев. 2.К раствору фермента с рН 4-10, преимущественно 7-8, добавляют Раствор кватернизованйрго сополимера акррлеина. с 4-винилпиридином. Весойое соотношение полимера и фермента в растворе можно варьировать от 1:1 до 30:1, при этрм лучше использовать раствор, содержащий кофакторы или субстраты фермента, Добавление полимера приводит к образрванию прочного ковалентно1-х крмгшекса с ферментом, сохраняющего высокую каталитичзскую активность и обладакидего пЬзвьшаёнИой стабильностью. Данный способ позволяет с большой простотой получатьводорастворимые стабилизированные ферменты, которые могут быть с успехом использованы в проточных реакторах мембранного Типа. Преим; 14ё.ствс) йблймер-ферментных кбмгшексрв такого типа заключается в ТРм; что благодаря присутсТ;Вшо рвободнйх: аЛьдеГидньих гЬупп в полййерной цёйй, не вступивших в реакцию , комйлексы могут быть легко иммобилизованы на различного тийа макропористых твердых ПОДЛОЖках содёрйсащйх свободные аминогруппы Лнапр имёр аминосиланиэированныё креМйёземы). Кррметого, наличие кватернйзРванйа5с пиридиновых колец, нёсу1;й йзс11О1Г рЯсительный заряд, позволяе проводить адсорбционную иммобиЛизацйю полйферментны;к комплексов на твердых йосйТёлях, именяцих отрицательный заряд (например пористые стеКла). Специфический эффект стабилизации а стивностй ферментов, содержащих сульфгйдрильные группа, сополимером айрШёийа с 4-винилпирйдином может быть рбусловлей также способностью пиридиновых колец связывать Б растворе ионы металлов, каталйзйрующих Необходимое окисление сульф гидрильных групп. Пример. 10 г 4-:8инилпиридийа растворйют в 50 мл диметилформамнда, содержащего 10 мг азо&исизобутиройитрила в качестве инициатора полимеризаций и добавляют 1 мл свежеперегнанногр акролеина. Раствор заливают в ампулу и откачивают воздух.Чапаянную ампулу помещают в термостат (60°С) и выдерживают 5-6 ч. Полимер осаждают диэтиловым эфиром. ; ; :, 5 ,,.. Выхрд продукта 7 г. Содержание акро . леинрвых звеньев, определенное окси минированием и по Ж-спектрам (при длине волны Л - 1715 см, соответс вующей валентным колебаниям ;, С - О группы), составляет 20%. 5 г полученного сополимера раст воряют в 10 мл этанола и добавляют 2 г диметилсульфта. Реакцию проводя при комнатной температуре в течение 1 сут. Продукт осаждают диэтиЛовым эфиром. Содержание кватернизоваинйгг пиридиновых колец определяется по ПМР-спектру или по ИК-спектру (используется соотношение интенЬивйОсти полос при длинах волн Л -1600 см пиридийовоё кольцо и я - 1640 см кватернизованное кольцо, и соЬтавляет 50 %. Пример2. К2мл раствора формиатдегидрогеназы (КФ 1, 2. 1. 2 (мол. вес. 96000) с удельной активностью 5 ед/мг и концентрацией 0,3-10% в фосфатном буфере с piH 7,Of содержащем НАД в концентрации 10 мг/мл, приливают 2 мл растйора сополимера акролеина с 4-винилпиРидином (20% альдегидных групп, 50% : алкилированйя, мол. вес 45000) концентрации 9-10 М (соотнсяиение полимер: фермент а 30:1). Смесь выдерживают при комнатной температуре 30 мин. Остаточная активность фармента после образования комплекса 9 Исследована стабильность формиатдегидрох-еназы в pacTBOjpe в фосфатном буфере при температуре в отсут -вие каких-либо добавок, в присутств 10 tfT/MJi НАД ив комплексе с поли мером в присутствии 10 мг/мл НАД . Из раствора отбирают пробы по 0,1 мл добавляют ;в.кювету, содер ащую 0,7 «фосфатного буфера рй 7,5,0,1 мл г; раствора НАД концентрации 10 мг/мл и 0,1 мл 3 М piacTBOpa формиата и измеряют скорость реакции окисления формиата, за которой следят спектро фотометрически по образованию воеоановлбнНой формы при длине волны 340 нм. Определены константы инактивации нативного фермента в присутствии.10 мг/мл НАД+ и комплекса фермента с полимером в Прйсутстзвии iO мг/мл НАД при . Соответствующие значения равны 3,2 3,0-10- мин. Как видно из этого примера,, стабильность фермента пе ёШ1ается примерно в 90 раз. и римерЗ.К2 мл раствора фо миатдегидрогеназы (КФ 1.2 .1.2) , . мол. вес. 36000 с удельной активност 15 ед/мг и концентрацией 210 М в фосфатном буфере рН 7,5, содержащем, формиат натрия в концентрации 0,6 М, прияи.вают 2 мл раствора сополи1 ера акррлеина с 4-винилпиридином (20% альдегидных групп-, 50% алкилированйя мол. вес около 45000) концентрация (соотношение полимер: фе эмент 1:1). Смесь выдерживают прикомнатной температуре 30 мин. Остаточная активность фермента после образования КОМпД1ёКса 95%. Исследована стабильность полученного комплекса в присутствии 0,3 М формиата натрия при 37®С. Нативный фермент в присутствии 0,3 М формиата полностью теряет активность через 500 ч, а комплекс сохраняет 50% активности через 800 ч и около 20% через 12000 ч. Пример4. КЗмл раствора глюКозооксидазы (КФ 1.1.3.4) концентрации 1,7«10 М, содержащего р,1 М KCf , pft 8,0 добавляют раствор сополимера акролеина с 4-винилпиридином (20% альдегидных групп, 50% алкилированйя, МЬл. вес около 45000) концентрацией 4-10 М. Смесь вьздер;живайот при комнатной температуре в течение 30 мин. Остаточная активность фермента после образования комплекса 100%. Исследована термостабильность глюкозооксидазы в paci:воре при темпёрйтуре и рН ,5,6. Из раствора отбирают ;пробы по 50 мкл и добавляют к 1 мл раствора D - глюкозы концентрации 10 м в фосфат- . ном буфере Pfl 5,8. Активность определяет :вольта1Ййё 6Мё 1рй 1 Ькйм Методом, измеряя убыль растворенного кислорода S пробе.кислородньам электродом Кларка при температуре 25С и рН 5,8. Активность расчитывают по лине.йному участку ;графика за исимасти тайгёнсаугла наклона йзменёния ока от 1врГёШйй7 Определяют константы инаКтйваЙий первого порядка натйвного фермента и. фермента в комплексе с полимером. Соответствующие значения составляют 7,8-10 и 4-10 . Таким образом, стабильность фермента возрастает приблизительно в 20 раз. Формула изобретения . I. Способ получения водорастворимых комплексов ферментов класСа оксидоредуктаз путём обрабсэтки ферментов водораствориквоми полимерами, от л и ч а ю 1Д и и с я тем, что с целью повышения Стабильности ферментов с одновременным сохранением высокого уровйя ферментативной активности, а также с целый повышения технелогичности использования водораст воримых комплексов ферментов, в качестве водорастворимых полимеров используют сод зяаидае альдегидные группы кватернизованнЫе сопрлимеры акролеина с 4-винилпи)ридином. 2. СпЬсоб по п. 1,отлича ющ и и с я тем, что фермент и.полимер берут в соотношении 1:1 - 1;3р по в.есу. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Иммобилизованные ферменты под ред. И. В. Березина|В. К. Авто7662557 8

нова, К, Мартинека, изл. МГУ,4.E.Bpown, А.Т ас015,Етр6о1 des vana1976. dans derives de euKease insoBub2.1.bpton,O.V.McLapen,r.H,Thoma5,Can-Ees dans Eean. Tetrahedron Lett 50,

bohydrate Res., 22, 30,.l972. 5077,1972,

3. Патент ФРГ.№ 2104810 5, Патент ОШ № 3860484

кл.,6а 22/10, 1971.кл. 195/63, 1975.