Способ получения стабилизированных ферментов,содержащих Sн-группы Советский патент 1981 года по МПК C12N9/96 C12N9/02 

Изобретение относится к энзимологии, а именно к способам получения ста билизованных ферментов, которые могут быть использованы, например, в проточных реакторах мембранного типа, в авто матических анализаторах биологических объектов и т. д. Известен способ получения стабилизированных ферментов, содержащих SHгруппы, заключающийся в обработке фермента водорастворимым полимером - со полимером акролеина и 4-винш1Пиридина в присутствии кофакторов или субстратов. Процесс проводят при рН 7,5. Полученные стабилизированные фермен ты сохраняют до 90% активности, стабильность возрастает в 20-90 раз по сравнению с нативным ферментом j Недостатками способа являются невысокие значения активности и стабильности получаемых ферментных комплексов; проведение реакции в присутствии больших количеств кофактора или субстрата фермента, так как при образовании ковалентных связей между альдегидными группами полимера и активными группами фермента часть из них, ответственная за каталитическую активность, модифицируется, что приводит к снижению активности фермента. Кроме того, необходимость поддерживать величину рН в очень узком определенном диапазоне 7(5 не всегда совпадает с оптимальной для активности величиной. Цель изобретения - повьшение активности и стабильности получаемых стабилизированных ферментов. Поставленная цель достигается согласно способу, заключающемуся в обработке фермента водорастворимым полимером на основе 4-винилпиридина, в частности, кватернизованным поли-4-винилпиридином при рН, соответствующем значению изоэлектрической точки фермента. 3 . Предпочтительно процесс ведут при мольном соотношении фермент : полимер (1-20) : 1. Суп ественными отличиями способа ЯВЛЯЮТСЯ;использование в качестве водорастворимого полимера на основе 4-винилпиридина кватернизованного поли -4-винилпиридина и проведение процесса при рН, соответствующем изоэлектри ческой точке фермента. Способ осуществляется следующим об разом. Проведение процесса при рН, соответствующем изоэлектрической точке фермента, связано с тем, что стабилизагля происходит за счет образования электростатического комплекса фермент полимер. Наблюдаемый эффект стабилизации обусловлен тем, что при комплексообразовании молекула полимера как бы опутывает молекулу фермента, в результате чего вокруг молекулы фермента образуется положительно заряженная оболочка, препятствующая проникновени к молекуле белка ионов металлов, явля ющихся катализаторами окисления существенных для активности SH-групп фермента, растворенным молекулярным кислородом. Наличие в молекулах полимера, описанного в известном сгфсобе альдегидных групп приводит помимо электростатического взаимодействия с ферментом, к образованию ковалентных связей между альдегидными группами носителя и МН2-группами (возможно так же SH-группами) фермента, что вызывае снижение его начальной активности и быструю потерю активности на начальной стадии инактивации. Так как используемый в предлагаемом способе полимер не содержит альдегидных групп (в отличие от используемого известного полимера), то модификации фермента не происходит, и процесс комплексообразования не сопровождается потерей активности. Кроме того, общий положительный заряд полимерной молекулы без альдегидных групп с тем же молекулярным весом значительно больше, а следовательно, эффект экранирования белковой глобулы заряженным полимером выше, чем в известном способе - в слу чае полимера с альдегиднымигруппами Это обуславливает увеличение активности и масштаба стабилизации ферментов поли- -винилпиридином по сравнению с полимером, описанным в известном способе. 6 .4 Образующийся электростатический комплекс фермента является прочным и не разрушается при высокой ионной силе раствора. Описываемый способ получения стабилизированных ферментов позволяет полностью сохранять начальную активность SH-ферментов, а также более чем в 500 раз повысить их стабильность. При этом процесс протекает без добавления субстратов и кофакторов при рН, оптимальных для действия ферментов. Пример 1.К2млО, раствора формиатдегидрогеназы (мол. вес 80000, уд. активность 10 ед/мг.) в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,2 приливают 2 мл 0,3 раствора в том же буфере кватернизованного поли-4-винилпиридина (степень, алкилирования 100%, мол. в. 40000). Иммобилизованный фермент полностью сохраняет свою активность. Стабильность комплекса, при 37 С, определяемая по кажущейся константе инактивации первого порядка, по глубине превращения 50% возрастает в 500 раз. Иммобилизованная формиатдегидрогеназа теряет 50% активности при 37°С в течение 800 ч, время полной инактивации нативного фермента 60 ч. Лучший показатель для формиатдегидрогеназы, иммобилизованной по известному способу, полученный при проведении процесса в присутствии формиата 300 ч. Синтез и фракционирование поли-4-винилпиридина проводят по методам, известным в литературе 2 Полимеризацию 4-винилпиридина осуществляют при перемешивании в толуоле, не содержащем кислорода, при 50 С. Готовый продукт несколько раз промывают толуолом и бензолом и высушивают до постоянного веса в вакууме при 40 С. Фракционирование поли-4-винш1Пиридина проводят пробным осаждением в системе четвертичный бутанол-бензол. Используют узкую фракцию полимера. Кватернизацию полй-4-винилпиридина осуществляют бромистым этилом в метаноле при в запаянных ампулах под аргоном. Пример 2. раствора формиатдегидрогеназы (мол. вес 80000, уд. активность 10 ед/мг) в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,2 приливают 2 мл М раствора в том же буфере кватернизованного поли-4-винилпиридина (степень апкили58рорания 100%, мол. в. 900000). Активность фермента.не изменяется. Полученный комплекс теряет при 37 С половину активности в течение 1350 ч. Пример 3. К2млЗЧОМ раствора алкогольдегидрогеназы из печени лошади (уд , активность 2 ед/мг) в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,8 приливают. 2 мл раствора в том же буфере кватернизованного поли-4-винилпиридида (100% апкилирование, мол. вес 40000). Иммобилизованный фермент полностью сохраняет свою активность. Полученный комплекс теряет половину активности при 37С в течение 600 в то время как нативный. фермент полно стью инактивируется за 30 ч, Формулаизобретения 1. Способ получения стабилизированных ферментов, содержащих SH-групп 6 « обработкой фермента водорастворимым полимером на основе 4-винилпиридина, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и стабильности получаемого продукта, в качестве водорастворимого полимера используют кватернизованный поли-4-винилпиридин, при этом процесс ведут при значениях рН, соответствующих изоэлектрической точке фермента. 2, Способ по п. 1, отличающийся тем, что процесс ведут при мольном соотношении фермент : полимер (1-20) : 1. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Авторское свидетельство СССР № 662357, кл. С 07 G 7/02, 976(прототип). 2.Onductr. Eng Chem. 1950, 42, 1603-1606. 3.G . Polymer. Sci., 1956, 22, 463-476.