Способ получения иммобилизованной глюкозоизомеразы Советский патент 1981 года по МПК C12N9/92 C12N11/14 

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения иммобилизованной глюкозоизомеразы, которая может найти применение для получения глюкозо-фруктозного сиропа из гидроли заторов крахмалосодержащего сьгрья для нужд пищевой промьшшенности. Известно получение иммобилизованной глюкозоизомеразы различными способами, например путем ковалентног п связывания фермента с полимером, адсорбцией, включением в гель и т.д. Однако большинство известных препа ратов иммобилизованной глюкозоизомера зы обладает или низкой активностью, или мгаой стабильностью (время полужизни препаратов составляет от 42 ч до 40 дн.). Наибап.ее близким к предлагаемому по технической сущности является способ получения иммобилизованной кпюкозоизомеразы путем связывания фермента в буферном растворе с неорганическим Si-содержащим носителем ( в качестве которого обычно используется пористое стекло) с помощью сшивающего агента глутарового альдегида 2j. При иммобилизации сохраняется 56% первоначальной активности, препарат теряет половину активности в течение 30 дн. Однако дпя известного способа ха- рактерны недостаточно высокие значения активности и стабильности получаемого продукта. Кроме того, глутаровьй- альдегид является ингибитором глюкозоизомеразы. Применение глутаролого альдегида в качестве сшивакщего агента отрицательно сказывается на активности и стабильности получаемого препарата из-за малой длины углеродной цепочки молекулы глутарового альдегида. Целью изобретения является повьшение активности и стабильности полу- чаемого препарата. Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилизованной глюкозоизомеразы путем связывания фермента в буферном раство ре с неорганическим Si-содержащим носителем с помощью сшивающего агента, в качестве последнего используют кватернизованный сополимер винилпиридина с акролеином. Кроме того, в качестве неорганического Si-содержащего носителя обычн используют аминированныйсилохром, а в качестве глюкозоимеразы - глюкозоизомеразу Act nomyces ol ivoci nereus 154. Использование в качестве сшиваюDiero агента кватернизованного сополимера винилпиридина с акролеином позволяет достаточно отдалить фермент от носителя и избегнуть отрицательного влияния матрицы. Способ осуществляют следующим образом. К аминированному силохрому добавляют водный раствор кватернизованного сополимера винилпиридина с акролеином в фосфатном буфере рН 7,6. К Получен ному продукту добавляют глюкозоизомеразу, соли магния и кобальта и инкубируют в течение 6 ч при перемешивании. Иммобилизованную глюкозоизомера зу отделяют от раствора и хранят при в фосфатном буфере рН 7,6. Полученный таким путем фермент сохраняет58-62% первоначальной акти ности, имеет рН - оптимум 7,5 (рН оптимум нативного фермента 8,5) и со храняет через 3 месяца работы в реак торе с перемешиванием 56% своей активности. При хранении при 4 С в теч ние года препарат иммобилизованной глюкозоизомеразы практически не теря ет активности. Пример. 1 г аминированного ЗГ -аминопропилтриэтоксиланом макропо ристо о силохрома (размер пор 700 1000 А, содержание аминогрупп 4,7 мг-экв/г) смешивают с 25 мл 1%-о раствора кватернизованного сополимер винилпиридина с акролеином в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,6. Смесь осторожно перемешивают на роторе в течение 6 ч, затем носитель отмывают на стеклянном фильтре от несвязавшегося полимера тем же буфером до исчезнове ния в промывных водах поглощения при 255 нм. Полученный носитель с приши fbiM сополимером помещают в 60 мп 3,1%-ого раствора глюкозоизомеразы, содержащего МдЗСЦ в концентрации I 4 и CoCl2 в концентрации 1 х . 4 X . Смесь инкубируют в течение 6 ч при при осторожном перемешивании на роторе, осадок иммобилизованного фермента отделяют на стеклянном фильтре, промывают буфером до исчезновения глюкозоизомеразной активности в промывных водах. Полученный препарат сохраняет 62% исходной активности, имеет рН-оптимум 7,5; температурный оптимум 80°С. Через 3 месяца работы в реакторе с перемешиванием при 60 С препарат проявляет 56% своей первоначальной активности. При хранении при 4 С в течение года активность препарата практически, не меняется. Скорость конверсии глюкозы во фруктозу для иммобилизованной глюкозоизомеразы составляет 11,3 мг фруктозы в час, что лишь ненамного ниже значения для растворимого фермента (12,1 мг/ч), Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить стабильный препарат иммобилизованной глюкозоизомеразы, обладающий высокой ферментной активностью. Формула изобретения 1.Способ получения иммобилизованной глюкозоизомеразы путем связывания фермента в буферном растворе с неорганическим Si-содержащим носителем с помощью сшивающего агента, отличающийся тем, что, с целью повьш1ения активности и стабильности получаемого препарата, в качестве сшивающего используют кватернизованный сополимер винилпиридина с акролеином. 2.Способ по п. I, отличающийся тем, что в качестве неорганического S i-содержащего носителя используют аминированный силохром. 3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют глюкозоизомеразя Асtinomyces оlivocinereus 154. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Грачева И. М., Мосичев М. С. и Гавристова А. В. Глюкозоизомераза микроорганизмов. Сборник Итоги науки. Микробисшогия, т. 9, М., 1978, ВИНИТИ, с. 69-74. 2.Lee Y. Y.Wun К., Tsao G. Т. Kinetics and mass Transfer chara -58831754

cteristicsof glucose ipomerase im-etal I , S., Susukl , Plenum Press,

nx) on porous glass. Immobili- N-Y, London, 1975, p. 132-140 (протоtfed frisyme Technology, ed. H. H. We- тип).