СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМОГО ИММОБИЛИЗОВАННОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 1999 года по МПК C12N11/00 C12N11/08 C12N9/56 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу иммобилизации протеолитических ферментов, и может найти применение в медицине и ветеринарии при получении препаратов иммобилизованных ферментов.

Известны различные способы иммобилизации ферментов на носителях.

Известны способы иммобилизации путем адсорбции фермента на носителях с высокоразвитой поверхностью, а также путем включения фермента в различные гелевые структуры (Иммобилизованные ферменты. Под. ред. И.В. Березина. T.1, М., Изд-во МГУ, 1976, с. 79-140).

Недостатком таких способов является малая прочность связи фермента с носителем, в результате чего фермент в процессе эксплуатации может диффундировать с носителя в раствор.

Известны также способы иммобилизации, заключающиеся в ковалентном связывании фермента с предварительно активированным носителем. Активация носителя необходима для создания на нем функциональных групп, способных взаимодействовать с молекулами фермента.

Известен, например, способ получения иммобилизованного протеолитического комплекса, включающий растворение содержащего альдегидные группы носителя в буферном растворе и последующее присоединение протеолитического комплекса, полученного из Aspergillus oryzae KC. В качестве носителя используют ксилоуронид, растворенный в 0,1 М трис-оксиметиламинометановом буфере pH 8,05, а присоединение фермента осуществляют при соотношении носитель-фермент 1:1 - 3 (а.с. N 1041567, кл. C 12 N 11/10, опубл. 15.09.83. Бюл. N34).

Недостатки известного способа - дефицитный и дорогостоящий носитель - ксилоуронид, низкая стабильность целевого продукта, необходимость хранения препарата в условиях холодильника при 0-4^oC.

Известен также способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата (ИФП), включающий следующие последовательные стадии (а.с. N 730694, кл. C 08 B 37/02, опубл. 30.04.80, Бюл. N16):
1. Активирование носителя - декстрана с мол. массой 20 кДа, в реакции периодатного окисления (степень окисления носителя γ = 6-48%).

2. Приготовление реакционной смеси: окисленный декстран растворяют в воде до концентрации 50 мг/мл и смешивают с раствором фермента - террилитина, в 0,1 М боратном буфере pH 8,5.

3. Иммобилизация фермента: реакционную смесь перемешивают в течение 2 часов при 21±1^oC, затем добавляют 0,1 М раствор боратного буфера, содержащего боргидрид натрия и перемешивают еще в течение 40 мин.

4. Обессоливание ИФП: путем диализа на холоде (4±2^oC) против дистиллированной воды в течение 48 часов.

5. Отделение избытка несвязавшегося фермента гель-фильтрацией.

6. Лиофильное высушивание.

Получают препарат с удельной активностью 7,4 ПЕ/мг.

Недостатками известного способа являются - сложность процесса (длительный процесс активирования носителя, значительные затраты времени, энергетических ресурсов и сырья).

- низкое качество целевого продукта.

Ближайшим к заявляемому способу - прототипом является способ получения иммобилизованного протеолитического комплекса, заключающийся в следующем (а. с. N 1442548, кл. C 12 N 11/00, опубл. 07.12.88, Бюл. N45):
1. Протосубтилин Г10Х, представляющий собой комплекс бактериальных нейтральных и щелочных протеаз из Вас. subtilis, растворяют в 0,05 М боратном буфере pH 8,4 при 2-4^oC в течение 30 мин, а нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием при 7000 g в течение 30 мин. К полученному супернатанту добавляют 10%-ный водный раствор полиэтиленоксида с мол. массой 600 - 2000 Да, преимущественно 1500 Да, в соотношении носитель - протосубтилин 1: (7,5-8,5). Смесь фермента с носителем облучают тормозным γ - излучением в дозе 2,3 - 2,7 Мрад. При этом получают водорастворимый иммобилизованный ферментный препарат с протеолитической активностью 80 - 120 ПЕ/мл. Препарат представляет собой прозрачную жидкость желтоватого цвета, которую хранят при 4 - 8^oC.

Недостатками известного способа являются:
- недостаточно высокое качество целевого продукта;
- низкая стабильность препарата при хранении (через две недели хранения при комнатной температуре препарат теряет 80% активности).

Известно, что водные растворы иммобилизованных ферментных препаратов (ИФП) нестабильны в процессе хранения, поэтому задача получения высокостабильных лекарственных форм ИФП является актуальной.

Технической задачей изобретения является повышение стабильности целевого продукта.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Готовят реакционную смесь путем растворения протеолитического фермента (ПФ), преимущественно протосубтилина ГЗХ, в Na-фосфатном буферном растворе (pH 7,2 - 8,2) полиэтиленоксида (ПЭО) с мол. массой 1500 - 4000 Да при соотношении фермент: носитель 1:(2-6). Полученную смесь очищают путем солевого осаждения балластных белков и удаления последних фильтрованием. Фильтрат подвергают облучению тормозным γ-излучением в дозе 0,9 - 1,1 Мрад. К полученному иммобилизованному на ПЭО протеолитическому ферменту добавляют ПЭО с мол. массой 4000 Да в количестве 50-300 мг/мл, раствор подвергают стерилизующей фильтрации, фасуют во флаконы вместимостью 10 см³ по 1,2 и 5 мл и лиофильно высушивают.

В результате получают препарат с активностью 460 ПЕ во флаконе (коммерческое название "Имозимаза аморфная"), представляющий собой таблеткообразную пористую массу, от белого до белого с кремовым оттенком цвета, хорошо растворимую в воде. Срок хранения препарата при температуре до 20^oC составляет 2 года.

Получаемый заявляемым способом ИФП может быть применен в любой области медицины и ветеринарии для лечения различных заболеваний, где необходим ферментативный гидролиз белков некротических тканей и гнойных масс.

Определяющими существенными отличиями заявляемого способа от прототипа являются:
1. Ковалентное связывание фермента с носителем осуществляют при экспериментально подобранном, оптимальном соотношении фермент:носитель, равном 1: (2-6), что позволяет повысить качество и стабильность целевого продукта, так как при соотношении фермент - носитель менее 1: 2 не достигается устойчивой стабилизации, а при соотношении более 1: 6 происходит частичное осаждение ферментативного белка носителем.

2. Перед иммобилизацией проводят очистку ферментного препарата от балластных белков путем последовательного добавления в реакционную смесь фосфорнокислого натрия и хлористого кальция. В результате реакции

происходит коагуляция и осаждение балластных белков, чему способствует выпадающий в осадок фосфат кальция. Данная стадия позволяет простым способом (без использования центрифугирования) обеспечить освобождение от балласта, что способствует повышению качества целевого продукта и снижению дозы тормозного γ-излучения в 2-3 раза по сравнению с прототипом (с 2,3 - 2,7 до 0,9 - 1,1 Мрад).

Перед лиофилизацией в ИФП вводят целевую добавку (наполнитель), в качестве которой используют ПЭО с мол.массой 4000 Да в количестве 50 - 300 мг/мл, что позволяет предохранить ИФП от потери активности при лиофильном высушивании, а также повысить стабильность препарата при хранении. Неожиданно оказалось, что именно данный синтетический полимер - ПЭО с мол. массой 4000 Да в концентрации от 50 до 300 мг/мл является оптимальным наполнителем для получения лекарственной формы ИПФ, так как он одновременно выполняет функцию и стабилизатора и структурообразователя, позволяющего получить после лиофилизации таблеткообразную пористую плотную массу препарата. Использование ПЭО-4000 в качестве наполнителя вызвано также его доступностью (выпускается отечественной промышленностью), разрешенностью использования в медицине и приемлемой ценой.

В таблице 1 представлены данные по влиянию добавок ПЭО-4000 на качество целевого продукта (формирование таблетки).

Из таблицы 1 видно, что добавление к ИПФ ПЭО-4000 в количестве 50 - 300 мг/мл, преимущественно 50 - 100 мг/мл, обеспечивает формирование таблеткообразной плотной массы препарата.

В табл. 2 и 3 представлены данные по хранению лиофильно высушенного препарата "Имозимаза" при комнатной температуре (18 - 20^oC) в сравнении с хранением жидкой формы препарата, полученного по способу - прототипу.

Из табл. 2 и 3 видно, что через 28 дней хранения при температуре 20 - 25^oC ИФП, полученный по способу - прототипу теряет 50 - 78% исходной протеолитической активности, а через 12 месяцев хранения потеря активности составляет более 95%. ИФП, полученный заявляемым способом, может храниться при комнатной температуре без потери активности в течение 12 месяцев.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Готовят реакционную смесь. Для этого 30 г ПЭО-1500 растворяют в 300 мл 0,025 М Na-фосфатного буфера (pH 8,2), добавляют 7,5 г протосубтилина ГЗХ (соотношение фермент: носитель 1:4), смесь перемешивают при температуре 18- 20^oC в течение 30 минут. Затем проводят осаждение балластных белков путем коагуляции. Для этого в смесь последовательно добавляют до полного растворения 1,3 г натрия фосфорнокислого (Na₂HPO₄•12H₂O) до конечной концентрации 0,45% и 1,9 г хлорида кальция (CaCl₂•6H₂O) до конечной концентрации 0,63%. После добавления хлорида кальция в реакционной смеси выпадает осадок нерастворимого фосфата кальция, который адсорбирует балластные белки. Смесь выдерживают 12 часов при температуре +4 +8^oC для полного осаждения балластных белков. Далее реакционную смесь фильтруют через бумажные фильтры ("белая лента"). Объем фильтрата составляет 300 мл. Полученный фильтрат облучают тормозным γ-излучением в дозе 1 Мрад. В процессе облучения происходит иммобилизация фермента на полимерном носителе. Выход по активности составляет 85%. После облучения в раствор, содержащий иммобилизованный на ПЭО-1500 протосубтилин (ИФП), вводят ПЭО-4000 в количестве 15 г на 300 мл раствора (50 мг/мл) и перемешивают до полного растворения. Затем проводят стерилизующую фильтрацию полученной смеси через мембранный фильтр (Millipore) с размером пор 0,2 микрона. Стерильный фильтрат разливают в стерильные флаконы вместимостью 10 см³ по 1 мл и лиофильно высушивают. После лиофилизации получают препарат, содержащий в одном флаконе 6,4 мг ИПФ (по белку) с активностью 300 ПЕ, 100 мг ПЭО-1500, 50 мг ПЭО- 4000.

Препарат растворяется в воде в течение 1 минуты, сохраняет стабильность в течение 2 лет.

Пример 2.

Готовят реакционную смесь. Для этого 75 г ПЭО-1500 растворяют в 300 мл 0,025 М Na-фосфатного буфера (pH 8,2), добавляют 15 г протосубтилина, смесь перемешивают в течение 30 минут и последовательно добавляют до полного растворения натрий фосфорнокислый до конечной концентрации 0,45% и кальций хлористый до конечной концентрации 0,63%. Смесь выдерживают 12 часов до полного осаждения балластных белков, затем осадок отфильтровывают на бумажном фильтре. Полученный очищенный фильтрат (V - 300 мл) облучают тормозным γ-излучением в дозе 1,0 Мрад на ускорителе электронов ЭЛВ-2. Выход по активности составляет 86%. В раствор, содержащий ИФП добавляют 30 г ПЭО-4000 (100 мг/мл), перемешивают до полного растворения, проводят стерилизующую фильтрацию полученной смеси через мембранный фильтр с размером пор 0,2 микрона. Стерильный фильтрат разливают в стерильные флаконы вместимостью 10 см³ по 1 мл и лиофильно высушивают. Один флакон содержит 13 мг ИПФ (по белку) с активностью 660 ПЕ, 250 мг ПЭО-1500, 100 мг ПЭО-4000.

Препарат сохраняет стабильность в течение 2 лет при хранении при температуре не выше 20^oC.

Пример 3.

Способ осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что соотношение фермент: носитель в реакционной смеси устанавливают 1:2. Для этого 30 г ПЭО-1500 растворяют в 300 мл 0,025 М Na-фосфатного буфера (pH 8,2), добавляют 15 г протосубтилина и смесь перемешивают. К полученному после иммобилизации ИПФ добавляют ПЭО-4000 в количестве 300 мг/мл. Один флакон препарата содержит 17 мг ИПФ (по белку) с активностью 720 ПЕ, 100 мг ПЭО-1500, 300 мг ПЭО-4000.

Пример 4.

Способ осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что соотношение фермент: носитель в реакционной смеси устанавливают 1:6, а в качестве носителя используют ПЭО-4000. Для этого 30 г ПЭО-4000 растворяют в 300 мл 0,025 М Na-фосфатного буфера (pH 8,2), добавляют 5 г протосубтилина и смесь перемешивают. Перед лиофилизацией к раствору ИФП добавляют ПЭО-4000 в количестве 50 мг/мл.

Один флакон препарата содержит 1,8 мг ИПФ (по белку) с активностью 190 ПЕ, 150 мг ПЭО-4000.

Использование предлагаемого способа позволяет по сравнению с прототипом:
- повысить качество целевого продукта;
- увеличить стабильность препарата ИПФ ("Имозимаза") в процессе хранения,
- обеспечить возможность получения устойчивой таблеткообразной пористой массы.

Изобретение относится к биотехнологии, может найти применение в медицине и ветеринарии для лечения различных заболеваний, где необходим ферментативный гидролиз белков некротических тканей и гнойных масс, а также гидролиз фибрина и растворение тромбов крови. Иммобилизацию протеолитического фермента, преимущественно протосубтилина, проводят на полиэтиленоксиде с молекулярной массой 1500-4000 Да путем облучения тормозным γ-излучением дозой 0,9-1,1 Мрад, при соотношении фермент-носитель 1:(2-6). При этом перед иммобилизацией реакционную смесь очищают от балластных белков солевым осаждением с помощью фосфата натрия и хлорида кальция. Добавляют полиэтиленоксид с мол. массой 4000 Да в качестве наполнителя в количестве 50-300 мг/мл и подвергают лиофильному высушиванию. Способ позволяет получить лиофилизат иммобилизованного ферментного препарата, который сохраняет стабильность в течение двух лет при хранении при температуре до +20^oC. Способ обеспечивает получение лекарственной формы препарата в виде устойчивой таблеткообразной пористой массы. 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата, включающий приготовление реакционной смеси, содержащей протосубтилин с полиэтиленоксидом, с последующим облучением полученной смеси тормозным γ-излучением, отличающийся тем, что соотношение фермент - носитель устанавливают равным 1: (2-6), из реакционной смеси перед облучением проводят солевое осаждение балластных белков, а целевой продукт подвергают лиофильной сушке в присутствии полиэтиленоксида с мол.массой 4000 Да в количестве 50-300 мг/мл. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве носителя для иммобилизации фермента используют полиэтиленоксид с мол.массой 1500-4000 Да. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что балластные белки осаждают путем последовательного добавления в реакционную смесь сначала фосфорнокислого натрия до конечной концентрации 0,45%, а затем хлорида кальция до конечной концентрации 0,63%.